第二节　调控骨吸收相关信号通路

一、OPG/RANKL/RANK信号通路

OPG/RANKL/RANK是调控骨吸收代谢的重要调节轴之一，其在骨吸收代谢中起着重要作用。RANKL为膜上受体，是目前研究发现的调控破骨细胞分化、发育和骨吸收能力的唯一细胞因子。RANK为膜上跨膜受体，是RANKL发挥其生物学作用的膜上唯一受体；OPG是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族的成员之一，也被称为破骨细胞抑制因子，其可与RANKL竞争性地与RANK结合，从而抑制破骨细胞分化和骨吸收功能以及促进骨形成代谢。目前研究发现，OPG/RANKL/RANK分子轴在调控破骨细胞分化、成熟及骨吸收功能上扮演着重要的角色。即使在体外条件下，OPG/RANKL/RANK分子轴是破骨细胞分化的潜在激活因素。破骨细胞前体细胞既需要生长因子M-CSF来维持其生长，同时也需要RANKL来诱导其进行分化，并诱导转录因子c-fos、活化T细胞核因子1（nuclear factor-activated T cell 1，NFATc1）/NFATc2和NF-κB成员p50及p52的表达。RANK也可通过激活破骨细胞前体细胞中的c-fos和NFATc1/NFATc2来促进破骨细胞分化、成熟。另外，像很多细胞因子，如白介素（Interleukin，IL）1、6、12等被研究证实，它们可通过诱导成骨细胞表达RANKL作用于破骨细胞而形成。TNF-α不仅可通过直接刺激破骨细胞前体细胞，还可通过诱导干细胞表达RANKL和破骨细胞前体细胞表达RANK来促进破骨细胞的形成。作为调控骨吸收代谢的另一个重要细胞因子——肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）。研究发现，敲除TRAF6后会导致严重的骨质疏松发生，提示TRAF6与OPG/RANKL/RANK信号通路之间存在密切的相互调控关系。另一研究检测了RANK受体上的TRAF6结合位点，提示TRAF6可能在破骨细胞功能发挥和正常的F-肌动蛋白（actin）指环形成上起着重要的作用，并且其他TRAF参与信号通路可能对于RANK调控破骨细胞形成起着重要的作用。然而，在一项利用TRAF2被敲除的破骨细胞前体细胞的研究中发现，TRAF2对RANK信号通路起着很小的作用，却依赖TNF-α调控破骨细胞形成过程中起重要作用。研究证实，在破骨细胞中RANK信号通路的下游TRAF6可激活Jun激酶（Jun kinases，JNK）、Akt/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、p44/42ERK、p38MAPK和经典NF-κB通路等。非受体酪氨酸激酶（c-Src）通过调控RANK激活，使c-Src参与正常的破骨细胞发育中。在一个有关破骨细胞分化的研究中，发现了一个对RANK信号通路的共刺激信号通路。该通路包括含有DNAX相关蛋白12（DNAX activator protein 12，DAP12）和Fc受体g亚基（FcRg）的DNAX免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine based activation motif，ITAM）。这个共刺激信号通路通过激活下游蛋白酶（Syk），其激活磷酸化酶Cg（phosphorylase Cg，PLCg）、Bruton酪氨酸激酶（Bruton's tyrosine kinase，BTK）和Tec激酶等参与RANK调控破骨细胞形成，甚至导致NFATc1/NFATc2的钙离子调控的相关通路激活。OPG是RANK信号通路的负向调控因子，是RANKL的诱饵样受体。体外研究发现OPG能抑制破骨细胞生成，当其在小鼠体内高表达时会诱导骨质疏松的发生。综上，OPG/RANKL/RANK分子轴可通过调控其下游的相关信号通路或靶基因的表达，经不同的途径影响破骨细胞分化、成熟以及骨吸收功能，进而影响骨吸收代谢，提示OPG/RANKL/RANK分子轴在骨吸收代谢中起着重要的作用。

OPG/RANKL/RANK为一分子轴，通过调控下游的多条信号通路从而调控破骨细胞生成和骨吸收代谢，如CN/NFATc1、PI3K/Akt、NF-κB、JNK/AP-1等信号通路。在以下的研究中，我们将对这些信号通路进行详细的阐述。

二、CN/NFAT信号通路

CN/NFAT信号通路是破骨细胞中与OPG/RANKL/RANK分子轴密切相关的一个信号通路。NFAT是一种钙离子调节性转录因子，CN活化后，迅速转录进入细胞核内并与相应的靶基因结合，调控其转录进而影响破骨细胞的分化、成熟以及骨吸收功能。目前，有关CN/NFAT信号通路调控破骨细胞分化、成熟以及骨吸收代谢的相关研究较少。研究发现，CN/NFAT信号通路调控破骨细胞分化、成熟以及骨吸收代谢主要有两条途径：① TRAF6磷酸化下游的CN，上调PI3K的表达，表达上调的PI3K激活PKB的表达，进而抑制GSK-3β，抑制下游的NFATc1表达，磷酸化后的NFATc1转移入核，激活其下游相关靶基因的表达，调控破骨细胞的分化、成熟以及骨吸收功能；② TRAF6磷酸化下游的Src，从而激活磷脂酶C（phospholipase C， PLC）及其下游的三磷酸肌醇（inositol triphosphate， IP3），激活后的IP3可促进Ca离子释放，Ca离子浓度升高使得CN活化，从而激活下游的NFATc1，磷酸化后的NFATc1迅速转移入核，进而影响调控破骨细胞分化成熟和骨吸收功能的相关基因表达。综上，CN/NFAT信号通路在破骨细胞分化成熟和骨吸收功能发挥中起着重要的作用。但是，目前有关CN/NFAT信号通路发挥作用的生物学机制研究并不是很深入，其与很多通路之间的相互作用关系尚不是很清晰，这将是以后骨生物学研究的热点，值得深入研究。该信号通路的深入研究对于了解骨质疏松的发病机制，治疗骨质疏松的药物靶点等具有重要的现实意义。

三、PI3K/Akt信号通路

近年来研究发现，PI3K/Akt信号通路在很多生物学过程如骨吸收代谢、细胞周期调控、细胞凋亡、血管新生、端粒酶活性和细胞侵袭性等诸多方面起着重要的作用。根据底物和同源异聚体的不同，可将PI3K构成的脂肪酶分为：Ⅰ～Ⅲ 3种亚型。在这3种亚型中，PI3K中的Ⅰ型与骨组织新陈代谢存在密切关系。PI3K的Ⅰ型（异源二聚体）分别是由1个分化和调节亚基构成，其催化亚基包括p110α、β、γ和δ，由基因PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG和PIK3CD进行编码的，一旦被激活，PI3K的催化亚基使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（triphosphoinositide， PIP2）转变成3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）。接着，PIP3招募一系列的包含PH结构域的信号蛋白如磷酸肌醇依赖的激酶1（PDK1）、Akt和PKB等，从而发挥其相应的生物学作用。Akt包括三个亚型，即Akt1、Akt2和Akt3，这三个亚型在氨基酸水平上均具有高度的同源性，并且当被磷酸化后均可被激活。Akt可在激酶区域被PDK-1在苏氨酸308（Thr308）上磷酸化从而导致其部分被激活，并且随后在Akt的C端调节区域的色氨酸473（Ser473）上被许多蛋白激酶如PDK-1、整合素连接激酶（integrin linked kinase，ILK）、DNA依赖蛋白酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）、mTORC2或者Akt本身所磷酸化，从而使得Akt完全被激活并转移到细胞膜上。此后，激活后的Akt从细胞膜转移到胞质和细胞核，从而磷酸化、激活或者抑制许多下游的靶基因进而调控多种细胞功能，发挥相应的生物学作用。

Akt信号通路下游最重要的细胞因子是mTOR，其是一个相对分子质量为289 000的色氨酸/苏氨酸激酶。在哺乳动物的细胞中，哺乳动物雷帕霉素（mammalian target of rapamycin， mTOR）存在两种不同的蛋白复合体，即mTORC1和mTORC2。研究发现，mTORC1的生物学作用较mTORC2要强大，其在骨组织新陈代谢中发挥重要的作用。然而，Akt可被结节性硬化复合物2（tuberous sclerosis complex-2， TSC2）磷酸化，抑制TSC1/TSC2异聚体。抑制的TSC1/TSC2异聚体使得GTP-结合蛋白Rheb仍处于激活状态，引起mTORC1活性的提高。激活的mTORC1调节核糖体蛋白S6激酶（S6K）和真核生物转移启动因子4E-结合蛋白1（4E-binding protein 1，4EBP1）的磷酸化，随后引起真核生物转移启动因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）的释放。以上生物学过程在蛋白转移和细胞循环过程中均起着重要的作用。另外，Akt可磷酸化并降低色氨酸/苏氨酸激酶——GSK-3β，从而导致其下游的细胞周期蛋白（cyclin）D1和Myc表达下调。Myc是一肿瘤蛋白，其可上调cyclin依赖激酶4（CD4）的表达。叉头框转录因子O亚家族蛋白1（forkhead box O1，FOXO1）调控的Akt抑制会刺激CDK抑制剂p27和p21表述下调，加速细胞的循环次数。另外，有研究也发现Akt激活的另一个靶基因是NF-κB。Akt激活κB（IκB）激酶（IκB kinase，IKK）抑制剂的活性，导致IκB磷酸化和降解以及NF-κB释放。一旦NF-κB释放，可迅速转移进入核内，并调控其下游靶基因的转录。

PI3K/Akt信号通路不仅在多种生物学过程中发挥着重要作用。近来研究证实，PI3K/Akt信号通路还在破骨细胞分化、成熟以及骨吸收代谢过程中均扮演重要的角色。多项研究也验证了以上论断，发现PI3K/Akt信号通路被激活后可通过抑制Runx2、Osx及Coll等表达来促进造血干细胞向破骨细胞的分化、成熟及骨吸收功能，降低骨密度。并且，BMSCs的运动功能和旁分泌功能发挥也依赖于PI3K/Akt信号通路激活。综上，目前有关PI3K/Akt信号通路的相关研究主要集中在体外，发现激活PI3K/Akt信号通路后促进了破骨细胞分化，同时抑制成骨细胞分化及成骨能力。而目前有关该信号通路在体内的研究较少，其作用于破骨细胞进而影响骨吸收代谢以及成骨细胞影响骨形成代谢的相关研究尚未见报道，其具体生物学机制尚不清晰。相信这将是骨代谢研究方面的又一个方向。另外，有研究也报道，PI3K/Akt信号通路在细胞自噬的调控上也具有重要的作用。目前，有关PI3K/Akt信号通路的很多生物学作用及机制尚不清晰，尚待深入研究。

四、NF-κB信号通路

NF-κB是一类转录因子家族，包含许多能穿过核膜的细胞因子。当它们穿过核膜进入核内后可与特异性的启动子结合从而启动多种细胞因子的表达，进而在多种正常细胞功能和发育过程中发挥作用。目前研究已发现的NF-κB家族成员主要包括NF-κB1、NF-κB2、RelA、RelB和c-Rel等。NF-κB的这些亚基可通过它们的Rel N端形成同源或异源异构体。NF-κB的激活因子主要有RANKL、TNF-α、Toll样受体配体（TLR）、CD40L及IL-1等。刺激这些细胞因子的表达变化可诱导配体/受体特异性远端蛋白的组合，如特异性的适应蛋白TNF受体-结合因子（TNF receptor-combination of factor， TRAF）。下游的蛋白如TAK1、NIK、IKK1、IKK2和IKKγ/NEMO促进稳定的Map酶和NF-κB复合体的形成。激活的酶复合体可磷酸化NF-κB抑制蛋白——IκBα，然后经过蛋白逐级降解从而向核内转移，并激活不同的NF-κB二聚体。研究证实，NF-κB信号通路在关节炎发病、细胞凋亡、癌症发生、细胞自噬及骨组织新陈代谢等多个生物学过程中均具有重要的调控作用。

目前，NF-κB信号通路在骨组织新陈代谢过程中扮演着重要的角色，尤其是在破骨细胞分化、成熟以及骨吸收代谢过程中。由于破骨细胞功能的完全缺失而导致小鼠的骨硬化病。NF-κB在骨组织代谢中的作用是在将NF-κB1/p50和NF-κB1/p52两个亚基同时敲除后发现的。进一步研究发现，NF-κB1/p50和NF-κB1/p52两个亚基的敲除是因为阻碍了破骨细胞的分化而不是通过作用于骨吸收功能从而导致相关疾病的发生。研究证实，破骨细胞分泌的细胞因子如RANKL可诱导敲除NF-κB的前体细胞分化为破骨细胞。随着对RANKL/RANK信号通路的发现和对其生物学功能研究的逐渐深入，发现RANKL与其同源受体RANK的结合会激发NF-κB各亚单位在细胞中发挥作用，从而形成IKK复合物。而各种细胞因子如TAK1、TRAF6和IKKγ/NEMO所包含的复合物可导致IKK2的磷酸化和随后的激活。激活的IKK2可磷酸化抑制蛋白IκB，而其被26S蛋白酶体迅速降解从而导致p65/RelA和p50的迅速释放和积累。这些NF-κB亚基形成二聚体并转移入核，从而激活其下游靶基因的表达。这种快速反应在受到刺激后的几天后仍会存在，并会使NF-κB的亚结构RelB和p52呈现缓慢和较为长久的生物学作用。研究证实，RANKL、RANK以及RANKL/RANK信号系统与NF-κB之间存在着密切的关系，抑制RANKL、RANK或者RANKL/RANK信号系统均会抑制破骨细胞分化，导致骨吸收功能和骨组织新陈代谢的紊乱。目前相关研究较多，均证实了NF-κB是调控破骨细胞分化成熟以及骨吸收功能的重要途径。综上，NF-κB信号通路通过调控其下游靶基因NFATc1、c-fos等表达，进而影响破骨细胞分化产生和骨吸收代谢。

随着有关破骨细胞分化产生、成熟以及骨吸收代谢的相关研究逐渐深入，很多以前不了解的生物学作用及机制逐渐被发现，但仍存在较多的未知，期待广大科研工作者后续的研究。