2.2 工业常用有机杀菌剂作用机理
2.2.1 苯酚类
常见苯酚类杀菌剂见图2⁃6。
图2⁃6 常用苯酚类杀菌剂
苯酚类杀菌剂的杀菌机理:低浓度时,与合成细胞壁的酶反应,导致细胞裂解;高浓度时,有总体原浆毒性,导致细胞质凝聚,而且还可以影响细胞膜,首先导致钾离子流失,其次是细胞质逸出;五氯酚还可以抑制电子转移链,从而抑制微生物代谢活性。苯酚类物质一般对革兰氏阳性菌和阴性菌都有效,但是对细菌孢子和耐酸细菌活性较低。
另外需注意,苯酚类物质一般是在非解离态下有抗菌活性,因而要注意这类物质使用时的环境pH值。苯酚对位被1~6个碳的烷基取代会增加其抗菌活性,继续增加碳链长度会因水溶性降低而使其抗菌活性变差,支链取代物活性不如直链取代物。卤代或硝基取代会增加苯酚的抗菌活性,因而通常使用的杀菌剂是同时被对位烷代及卤代物。联苯酚类,如果两个苯基之间是亚甲基(—CH2—)、硫(—S—)、氧(—O—)连接,则抗菌活性增加;而如果是—CO—、—SO—、—CHOH—则活性降低。
2.2.2 卤素类
一些含卤化物如碘、氯、溴及其携带物和释放体是重要的杀菌剂。氟有毒,刺激性和腐蚀性强,可用作消毒剂,但因氟化物毒性较强,对人类等脊椎动物骨骼有不可逆的伤害,故实际上并不常用。常用的卤素及其携带物和释放体见图2⁃7。
图2⁃7 常用的卤素及其携带物和释放体
碘和溴可以迅速渗透微生物的细胞壁,与细胞质中巯基发生氧化反应,因而破坏蛋白质和核酸的结构及合成从而引起微生物死亡。碘的携带物(图2⁃7中聚维酮碘)则扮演了携带和稳定的作用,缓慢释放增加了其杀菌作用的持久性。
氯的杀菌活性机理为氯可以作用于许多目标:例如氧化巯基酶和氨基酸;氯化芳香族氨基酸;通过攻击结构蛋白、碳水化合物和脂质从而破坏细胞壁和细胞膜;减少细胞间质;减少营养素及氧的摄取;抑制蛋白质合成;破坏氧化磷酸化过程和其他与膜相关的酶的活性;直接降解蛋白质成较小的多肽和沉淀;减少三磷酸腺苷的产生;破碎DNA及抑制DNA合成。有机氯(溴)比无机氯(溴)具有更低的刺激性和腐蚀性,并且具有更高的稳定性,杀菌更持久长效,但相比之下,杀菌效果更慢。
2.2.3 醇类
常见的醇类杀菌剂有乙醇、正丙醇、异丙醇、三氯叔丁醇、布罗波尔、苯甲醇、苯乙醇、苯氧乙醇等。它们的结构见图2⁃8。
图2⁃8 常用醇类杀菌剂
通常醇类具有快速的杀菌活性,包括耐酸菌,但不具有杀孢子作用,它们杀病毒的活性较低,但对部分病毒具有杀灭作用。醇类通常在有部分水的氛围下活性更好,其杀灭机理是:破坏细胞膜,使部分重要蛋白失活,并进一步干扰代谢过程,最终使细胞裂解。此外,一些报道显示,醇类会导致大肠杆菌中脱氢酶的变性,并因抑制代谢过程而导致产气肠杆菌滞后期延长。
2.2.4 醛类物质
工业上常用作杀菌剂的醛类物质主要有四类(种),分别是甲醛、戊二醛、芳香醛[如邻苯二甲醛(OPA)]及醛释放剂。具有代表性的醛类物质见图2⁃9。
图2⁃9 醛类及醛释放剂
甲醛缓释体(释放体)类防腐剂主要是通过在水性体系中,缓慢地释放出极少量的游离甲醛,从而起到杀灭微生物的作用。也就是说甲醛释放体虽不同于甲醛,但两者的根本都是依靠甲醛分子来杀菌。醛类物质杀菌机理是:醛通过烷基化与蛋白质和核酸等相关的各种化学基团交联,随后交联成大分子(图2⁃4)。甲醛更易与蛋白质结合,因而在含蛋白质类物质的存在下杀菌效果较差。甲醛通过将其自身连接到伯酰胺和氨基上,随后,甲醛导致分子间交联具有酚或吲哚残基的蛋白质或氨基。除了与具有许多末端氨基的重要蛋白反应,甲醛也可以与核酸碱基的氨基反应,尽管它与脱氧核糖核酸(DNA)的反应性远低于核糖核酸(RNA)。戊二醛的作用机制则涉及微生物的羟基、氨基、羧基和巯基的烷基化,其影响RNA、DNA和蛋白质合成。另外,戊二醛还可以导致细胞膜中蛋白质和大分子的交联。孢子的细胞壁、真菌的细胞壁(壳多糖)和分枝杆菌细胞壁分别是戊二醛作用于细菌孢子、真菌和分枝杆菌的靶点。OPA与氨基酸、蛋白质作用,尽管不如戊二醛有效,然而,OPA是亲脂性的,有助于负载到革兰氏阴性菌和分枝杆菌的细胞壁上,补偿了其较低的交联能力。它的杀菌活性来源于一系列反应:通过交联与膜受体结合、损害膜功能从而使杀菌剂彻底穿透细胞膜,并与细胞内反应分子(如RNA)相互作用,损害细胞的生长周期,最后损害DNA。但卤代海因同时还可以释放出活性卤素,活性卤素同时起杀菌作用(图2⁃7)。
2.2.5 有机酸及其酯类
常用于作为防腐剂(杀菌剂)使用的有机酸及其酯类见图2⁃10。
图2⁃10 有机酸及其酯类
大部分此类物质杀菌的机理是:它们充当脱耦剂,阻止微生物摄取依赖于质子动力才能进入细胞的底物。也有些有机酸同时抑制电子传输或转移。自然,此类物质的抗菌活性受环境pH值的影响。
2.2.6 芳香二脒类
具有代表性的芳香二脒类杀菌剂见图2⁃11。
图2⁃11 芳香二脒类杀菌剂
芳香二脒类已被证实可抑制氧摄取并诱导氨基酸泄漏。另外,也可能显著损伤一些革兰氏阴性细菌的细胞膜。此外,芳族二脒可与DNA结合,有些可与核苷酸序列选择性结合。
2.2.7 胍类
各种胍类物质均具有杀微生物活性,包括氯己定、阿来西定、六亚甲基单胍类和六亚甲基双胍类及其聚合物。常见胍类杀菌剂见图2⁃12。
图2⁃12 常用胍类杀菌剂
其中氯己定对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌具有广谱的抗菌活性。但一些细菌,特别是变形杆菌和普罗威登斯菌属的菌株,可能对双胍具有高度抗性,耐酸细菌亦是如此。在血清、血液、脓液和其他有机物质存在下活性降低。由于其阳离子性质,在肥皂和其他阴离子化合物存在下其活性降低,在诸如碳酸氢盐、硼酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、磷酸盐和硬水中活性也被中和而降低。氯己定在pH=7~8时表现为两性离子而具有最大的杀菌活性。氯己定在较低浓度,如低于200μg/mL时,仅具有抑菌性,它能抑制膜上的酶并促进细胞成分的渗漏。随着浓度增加超过该值,细胞质成分会被凝固而体现出杀菌效果。此外,高浓度时也会抑制腺苷三磷酸酶(ATPase)并使膜电位崩溃。与氯己定抗菌机理不同,阿来西定和聚六亚甲基双胍盐酸盐(PHMB)的杀菌机理是诱导膜脂质(磷脂)相分离。据报道,PHMB也会与核酸反应。另外注意,由于PHMB聚合物上残留有正电荷,它会被阴离子化合物从水溶液中沉淀出来,因而所有阴离子化合物包括基于烷基硫酸盐的肥皂和洗涤剂、含六偏磷酸钠的去污剂以及强碱性环境都会导致沉淀析出。
2.2.8 过氧化物类
工业上常用的过氧化物类杀菌剂主要有过氧化氢、过氧乙酸、过氧甲酸等。其结构见图2⁃13。
图2⁃13 常用过氧化物类杀菌剂
过氧化物类杀菌剂是一类含有高活性羟基基团且具有环保、无毒、可生物降解特点的高效杀菌剂。其杀菌机理是:高活性的羟基基团易于与可氧化的基团反应,从而氧化蛋白质、酶和其他代谢物中的巯基和硫键,导致蛋白质变性,破坏细胞壁渗透性。
2.2.9 苯胺及其衍生物及脲类
苯胺类化合物都含有C6H5NHCOR基团。工业上常用的苯胺及其衍生物及脲类杀菌剂见图2⁃14。
图2⁃14 常用的苯胺及其衍生物及脲类杀菌剂
苯胺类化合物的抑菌作用是由于它们给部分质子动力过程充电,从而抑制了依赖于这个机制的过程如主动运输和能量代谢过程。此外,通过吸附和破坏细胞膜的半透性而导致细胞死亡。也有报道说水杨酰苯胺对生物酶/酶系统有螯合作用,抑制了细菌的双组分系统(发挥细菌毒性的信号传导装置)。
2.2.10 唑类
2.2.10.1 异噻唑啉酮类
含有活性N—S键的异噻唑啉酮类化合物例如苯并异噻唑啉酮(BIT)、N⁃正辛基异噻唑啉酮(OIT)、N⁃正丁基苯并异噻唑啉酮(BBIT)、二氯⁃N⁃正辛基异噻唑啉酮(DCOIT)等是工业上常用的一类杀菌剂。而与此类似的一些噻唑类杀菌剂与异噻唑类活性基团相似,杀菌机理相似,因而可放在一起论述。它们的结构见图2⁃15。
图2⁃15 常用含有活性N—S键的IT类及S键异噻唑酮类杀菌剂
异噻唑啉酮类杀菌剂是与硫醇相互作用的杀菌剂,微生物的死亡归因于异噻唑啉酮对蛋白质硫醇的破坏和产生了自由基,其反应机制见图2⁃5。它的作用可分两步:①快速抑制代谢和生长,这个过程包括破坏脱氢酶;②紧接着是导致不可逆的细胞损伤。因而,生长、呼吸和能量产生过程(ATP合成)被迅速抑制。在生长抑制浓度下,BIT对金黄色葡萄球菌的细胞膜完整性几乎没有影响,但可以显著抑制主动转运和氧化葡萄糖,因而对含巯基的酶有显著影响。含硫醇类化合物的存在会使异噻唑啉酮类杀菌剂,如甲基异噻唑啉酮(MIT)、氯代甲基异噻唑啉酮(CMIT)、BIT等失活。实际应用的实践中,有证据表明强还原性的物质或具有强氧化还原能力的物质亦会使MIT、CMIT、OIT等失活,但BIT类耐还原性能力增强,耐氧化性能力降低。
噻唑类杀菌剂因为亦含有活性硫键,活性硫键易于与蛋白质中含—SH组分相互作用,其杀菌机理与异噻唑啉酮类相似。
2.2.10.2 咪唑及其衍生物类
咪唑即1,3⁃二氮唑,是一个平面五元杂环芳香性有机化合物,酸碱两性。咪唑类基团具有良好的水溶性,可以增进药物在水中的溶解。该系列化合物结构见图2⁃16。
图2⁃16 咪唑及其衍生物类杀菌剂
咪唑类化合物因其结构相似性可以很容易地与蛋白质分子结合,因此,咪唑类杀菌剂表现出较好的药效学特征。此外,一些高浓度的咪唑类药物可对细胞膜发挥直接抑制作用,而不会干扰甾醇和甾醇酯。一些取代活性基团增强了咪唑类杀菌剂的活性。咪唑类杀菌剂通常用作防霉剂。还有许多含有咪唑基的杀菌剂,实际上该基团并不是主要活性基团,如海因类化合物等(图2⁃9),以及N—CH3OH这一类基团(其活性主要来源于—CH3OH),因而其杀菌机制与一般的咪唑化合物不同。实际上许多杀菌剂是多活性基团杀菌剂,其杀菌机理不能按照某一特定基团活性给予很好的解释。
苯并咪唑类杀菌剂是单唑类杀菌剂中一个子类,常见的此类杀菌剂有苯菌灵、多菌灵、氰菌灵、硫菌灵、噻菌灵、麦穗宁、唑菌灵等,部分结构见图2⁃17。
图2⁃17 苯并咪唑类杀菌剂
此图中虽然甲基托布津不是苯并咪唑结构,但它是多菌灵的前驱体,其杀菌作用机制与多菌灵一致。
苯并咪唑类杀菌剂可与微管蛋白结合而抑制微管组装,干扰大量涉及微管的细胞过程:如有丝分裂和减数分裂,细胞内分子、颗粒和细胞器的运输,通过纤毛和鞭毛的作用维持细胞的形状和细胞的流动性,阻止细胞核分裂。
2.2.10.3 三唑类
图2⁃18 三唑类杀菌剂
三唑类杀菌剂是一类比单唑类杀菌剂更优秀高效的杀菌剂。工业上常用的三唑类杀菌剂见图2⁃18。归于此类中的杀菌剂主要官能团就是三唑基团,其他可分解或水解释放甲醛等活性物质者不在此中。
三唑类杀菌剂杀菌机理是:抑制真菌内CYP450单加氧酶的活性,因竞争性吸附而破坏麦角甾醇的生物合成,导致细胞膜受到损坏,最终导致细胞死亡。三唑类杀菌剂可有效地防治大多数高等真菌,但对卵菌类无效。
2.2.11 三嗪类
属于三嗪类但杀微生物机理又不是甲醛释放类的常用工业杀藻剂类化合物见图2⁃19。
图2⁃19 常用三嗪类工业杀藻剂
均三嗪类杀菌剂实际上对细菌、酵母菌和霉菌基本无效,在工业上仅用于杀灭微型藻类。此类化合物作用机理是它们主要作用于光系统Ⅱ,是光合作用的有效抑制剂。而藻类(也是真菌中一类)通过光合作用由水和二氧化碳合成有机物,供自身或共生的霉菌需要。
2.2.12 有机硫制剂和有机金属化合物
工业上常用的有机硫制剂和有机金属化合物(配合物)杀菌剂主要有以下三类:代森类、福美类、吡啶硫酮类,它们的结构见图2⁃20。
图2⁃20 工业常用有机金属配合物杀菌剂
代森类杀菌剂作用机制:它们具有多点接触活性,为非特异性硫醇反应物。它们本身并没有杀菌活性,只是在水中水解释放出亚乙基双异硫氰酸酯硫化物(EBIS),然后转化为亚乙基双异硫氰酸酯(EBI)。EBIS和EBI都是活性毒物,会干扰含有巯基的酶。对核心酶的这种致命破坏抑制或干扰了真菌细胞质和线粒体内至少六种不同的生化过程。除此之外,重金属离子也有一定的杀菌作用,导致细胞超氧阴离子含量降低,细胞内谷胱甘肽(GSH)含量降低,可能导致细胞致死率增加。福美类杀菌剂作用机制与代森类相似。
吡啶硫酮类是细菌和真菌膜转运过程的一般抑制剂。真菌与巯氧吡啶的相互作用导致各种独立调节的运输系统的活性显著降低,包括无机硫酸盐、无机磷酸盐、甲胺、胆碱⁃O⁃硫酸盐、葡萄糖、L⁃蛋氨酸和几种疏水性L⁃α⁃氨基酸(一般氨基酸通透酶)。有证据表明活性物质是未离子化的分子,并且巯氧吡啶通过瓦解跨膜APH驱动力起作用。巯氧吡啶引起的转运抑制程度随着暴露于抑制剂的时间的增加而增加。然而,暴露时间和巯氧吡啶浓度没有相互关系。在“低”巯氧吡啶浓度下,转运抑制在某些有限值处稳定,真菌可以解毒低浓度的抑制剂。
2.2.13 其他表面活性剂、染料、螯合剂、渗透剂类
2.2.13.1 表面活性剂
表面活性剂分子结构中具有两个区域,一个是烃类疏水性基团,另一个是吸水性(亲水性或极性)基团。以亲水基团是否带电荷或有无离子化,表面活性剂分为阳离子型、阴离子型、非离子型和两性化合物。常见的阳离子型表面活性剂如季铵盐型(图2⁃3),其杀菌机理前已有述。阴离子型表面活性剂多用作去污剂,虽然亦有人报道它对革兰氏阳性菌有一定杀灭作用,但通常认为阴离子型表面活性剂基本上没有杀菌作用。常用表面活性杀菌剂见图2⁃21。
图2⁃21 常用表面活性剂(不含季铵盐类)
非离子型表面活性剂的性质主要取决于分子中亲水和疏水基团的比例。非离子型表面活性剂包括脱水山梨糖醇衍生物,例如聚山梨醇酯(吐温类,Tweens)。有人认为非离子型表面活性剂不具有杀微生物活性。然而,低浓度的聚山梨醇酯被认为影响革兰氏阴性细胞外被膜的渗透性,因此使其对各种杀微生物剂更敏感。非离子型表面活性剂也显示出抗真菌特性。
2.2.13.2 染料
有三种主要的染料可用作杀菌剂:吖啶、三苯甲烷类和醌。
常用的吖啶类染料杀菌剂见图2⁃22。
图2⁃22 常用的吖啶类染料杀菌剂
吖啶及其衍生物是广泛的血液治疗剂。它们具有抗菌、抗疟和抗肿瘤活性。这些活性与吖啶对DNA的高亲和力和相互作用有关。吖啶的多环平面结构可以插入DNA结构的碱基对之间,这种插入将干扰主要的代谢过程。此外,一些吖啶衍生物已被证明可干扰拓扑异构酶和端粒酶等关键酶。
三苯甲烷类:该组中最重要的成员是结晶紫、亮绿和孔雀石绿。它们常被用作局部防腐剂处理伤口和烧伤,对革兰氏阳性细菌有效,但对革兰氏阴性菌的影响要小得多,并且在血清存在下活性严重下降。三苯甲烷染料的活性来源于它本身通过阳离子和碱之间建立平衡而呈现假碱性。因此,电离和平衡常数都会影响其活性。杀微生物效力取决于外部pH值,在碱性条件下更明显。
蒽醌类染料最简单的成员是1,4⁃苯醌。仅对细菌、霉菌和酵母的毒性而言,萘醌的毒性最大,其次是菲醌、苯醌和蒽醌。可以通过卤化增加其杀微生物活性,两种强有力的农业杀真菌剂是氯代醌(四氯⁃1,4⁃苯醌)和二氯萘醌(2,3⁃二氯⁃1,4⁃萘醌)。其结构见图2⁃23。
图2⁃23 蒽醌类染料杀菌剂
此类物质杀菌机理是:①平衡反应弱结合;②形成“永久性”单一共价连接;③可逆共价键结合;④金属离子螯合和随后的DNA连接;⑤形成DNA沟和碱基特定连接;⑥插入超螺旋和双链,导致弛豫、延伸;⑦活性氧物质参与的氧化还原循环导致DNA单链断裂;⑧单链断裂并形成了磷酸三酯。
2.2.13.3 螯合剂
常用的螯合剂有乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(2⁃氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)等(图2⁃24)。科学家研究发现某些革兰氏阴性细菌在Tris缓冲液中存在EDTA时对溶菌酶变得敏感,并且EDTA可以单独诱导铜绿假单胞菌的裂解。EDTA可能影响各种革兰氏阴性菌细胞壁的渗透性,几种酶被释放到周围环境中,可能降解核苷酸和RNA。其他螯合剂机理与此相似。
图2⁃24 常用的螯合剂
2.2.13.4 渗透剂
部分渗透剂具有杀菌作用的机理是渗透剂可以改变膜的渗透性,甚至导致革兰氏阴性菌外膜脂多糖(LPS)的流失,有些渗透剂还可以络合细胞需要的一些重要的常量和微量金属阳离子。