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第四节 精液有形成分分析
测定精液中精子、生精细胞及上皮细胞等有形成分，为评价男性生育功能、捐精者精液质量、输精管结扎术后疗效和法医学鉴定提供依据。
一、精子存活率和活动率测定
精子存活率( motility)通过检测精子膜的完整性来评价，常用染料拒染法或低渗膨胀试验来鉴别细胞膜完整的精子，从而得出活精子的百分率。
(一)伊红染色法 【试剂】
5g/L伊红Y染色液:伊红Y0.5g，加9g/L生理盐水至100ml。
【操作】
1.在载玻片上加新鲜精液和伊红Y染色液各1滴，混匀后加上盖玻片，30秒后在高倍镜下观察，活精子头部呈白色或淡粉红色不着色，死精子头部呈红色或暗粉红色。
2.计数200个精子，计算未着色(活精子)的百分率。
(二)伊红-苯胺黑染色法 【试剂】 1.伊红Y染色液
将0.67g伊红Y和0.9g氯化钠溶入100ml纯净水中。
2.伊红-苯胺黑染色液
将10g苯胺黑加到配好的100ml伊红Y溶液中，加热至沸腾，然后冷却至室温，用滤纸过滤，存储于黑色密封玻璃瓶中。
【操作】
1.取小试管，加新鲜精液和伊红Y染色液各1滴，混匀。
2.30秒后加苯胺黑溶液3滴，混匀。
3.30秒后在载玻片上加精液、伊红-苯胺黑染色液的混合液1滴，制成涂片，待干。
4.油镜下观察，活精子为白色，死精子染成红色或暗粉红色，背景呈黑色。计数200个精子，计算未着色(活精子)百分率。
(三)精子低渗膨胀试验
精子低渗膨胀试验作为染料拒染法的替代试验，当必须避免精子染色的时候，如ICSI选择精子时，可采用此法。
【试剂】
膨胀液:枸橼酸钠0.735g，果糖1.351g，加蒸馏水至100ml。分装，－20℃冷冻保存，使用前解冻，并充分混匀。
【操作】
1.取小试管，加1ml膨胀液，37℃预温5分钟。
2.加0.1ml液化精液，轻轻搅匀，37℃孵育至少30分钟。
3.在相差显微镜高倍视野下观察，发生膨胀的精子通过精子形状的改变来辨别。如精子尾部卷曲为活精子。见图1-13-1。计数200个精子，计算膨胀精子的百分率。
图1-13-1 低渗情况人类精子典型变化图
注: ( a)无变化; ( b)～( g)尾部变化的不同类型，画线部分代表尾部膨胀区
【参考区间】
精子存活率58%～91%。
【临床意义】
精子存活率与活动率主要用于男性不育症检查，两者降低示男性生育力下降。精子活动率降低可见于精索静脉曲张;淋病、梅毒等生殖系统感染;高温环境、放射线等物理因素;应用某些抗代谢药、抗疟药、雌激素等;存在抗精子抗体等免疫因素。精子活动率低于40%可导致不育。
【注意事项】
1.标本应注意保暖，宜在保温镜台上进行观察。如室温低于10℃时，应将标本先放入37℃温育5～10分钟后镜检。
2.精子湿片检查若不活动精子过多，应采用体外活体染色法观察活精子数进行确证。湿片法和染色法操作简单，适合临床初筛检查。
3.某些标本试验前就有尾部卷曲的精子，在精子低渗膨胀试验前，计算未处理标本中尾部卷曲精子的百分数，实际精子低渗膨胀试验结果百分率就等于测定值减去未处理标本中尾部卷曲精子百分率。
二、精子活动力测定
精子活动力的检测常用传统显微镜法、连续摄影法和精子质量分析仪法。WHO推荐使用评估精子活力等级的简单系统。
【操作】
取充分混匀精液标本10μl制片，在高倍视野下观察约200个精子，并进行分级，首先计数前向运动( PR)和非前向运动( NP)精子，随后在同一视野内计数不活动( IM)精子。
【结果判断】
前向运动( PR) :精子主动地呈直线或沿一大圆周运动，不管其速度如何。
非前向运动( NP) :所有其他非前向运动的形式，如小圆周泳动、尾部动力几乎不能驱使头部移动或只能观察到尾部摆动。
不活动( IM) :精子没有运动。
【参考区间】
精子总活动力( PR + NP) 40%～78%，前向运动32%～72%。
【临床意义】
前向精子活动力的程度与妊娠率相关。精子活动力减低见于精索静脉曲张;生殖系统非特异性感染;应用某些抗代谢药、抗疟药、雌激素等。精子活动力是评估男性生育能力的重要指标。
【注意事项】
此检查受许多因素影响，如精液离体时间、环境温度、液化程度等。因此，最好在排精后尽快检查，尽可能在37℃环境中测定。
三、精子计数
【试剂】
精子稀释液:碳酸氢钠5g，40%甲醛溶液1ml，蒸馏水100ml，待完全溶解过滤后使用。
【操作】
1.于小试管内加精子稀释液0.38ml，取液化精液20μl，加入稀释液内混匀。
2.充分摇匀后，滴入改良Neubauer计数板的计数池内，静置1～2分钟，待精子下沉后，以精子头部作为基准进行计数。
3.如每个中央中方格内精子少于10个，应计数所有25个中方格内的精子数。
4.如每个中央中方格内精子在10～40个，应计数10个中方格内的精子数。
5.如每个中央中方格内精子多于40个，应计数5个中方格内的精子数。
【结果判断】
【参考区间】
精子计数( 15～213)×10 6/ml，精子总数( 39～802)×10 6/每次射精。
【临床意义】
每次射精的精子数与妊娠时间有关，并且可预测受孕。精子总数可以衡量睾丸产生精子的能力和男性输精管道畅通的程度。精液中精子浓度与受精率和妊娠率相关，精子数量受精囊腺和前列腺分泌液量的影响，不是衡量睾丸功能的特异性指标。精子计数是单位体积精液中的精子数目，是一个射出精子数目与稀释精子液体体积的函数。精子总数是一次完整射精的精液中的精子总数，由精子浓度乘以精液体积得出。
【注意事项】
1.出现一次异常结果，应间隔1周后复查，反复检查2次以上方能得出比较正确的结果。
2.如低倍镜、高倍镜检查均无精子，应将精液离心沉淀后再次涂片检查，如2次均无精子，报告“无精子”。
3.因统计学上符合泊松分布规律，为减少取样误差，必须计数足够数量的精子，最好计数400个以上的精子，使计数精密度能达到5%。
四、精子形态观察
【试剂】
改良巴氏染色液、Shorr染色液、Diff-Quik快速染色液:商品化染色液一般质量均佳，但实验室也可自行配制。
【操作】
1.在载玻片上滴1滴精液，约5～20μl，采用压片法或推片法制片。
2.将涂片浸入95%乙醇至少15分钟后做巴氏染色;或用75%乙醇固定60分钟后做Shorr染色;或用95%甲醇固定60分钟后做Diff-Quik快速染色。
3.在油镜下观察，至少计数200个精子，记录正常和异常精子的数量。
【结果判定】
评估精子正常形态时应采用严格标准，精子包括头、颈、中段、主段和末段，而光镜下可认为精子是由头(和颈)和尾(中段和主段)组成。只有头和尾都正常的精子才认为是正常的。精子头的形状必须是椭圆形，顶体区清晰可辨，约占头部的40%～70%，顶体区没有大空泡，并且不超过2个小空泡，空泡大小不超过头部的20%，顶体后区没有任何空泡;中段细长规则，约与头部长度相等，中段主轴应与头部长轴成一条直线，当残留胞质超过精子头大小1 /3时认为是残留胞质过量;主段应比中段细，均一，长约45μm，尾部应没有显示鞭毛折断的锐利折角，主段可自身卷曲成环状。
所有形态学处于临界状态的精子均列为异常。异常精子可有:①头部缺陷:大头、小头、锥形头、梨形头、圆头、无定形头、有空泡头、顶体过小头或过大、双头等;②颈段和中段缺陷:颈部弯曲、中段非对称地接在头部、粗的或不规则中段、异常细的中段等;③主段缺陷:短尾、多尾、发卡形尾、尾部断裂、尾部弯曲、尾部宽度不规则、尾部卷曲等，有时，可见残留胞质过量现象，见图1-13-2。
【参考区间】
正常形态精子4%～44% (异常精子应少于20%，如超过20%为不正常)。
【临床意义】
异常精子增多见于感染、外伤、高温、放射线、乙醇中毒、药物、工业废物、环境污染、激素失调或遗传因素导致睾丸异常、精索静脉曲张等。
五、精子凝集现象检查
精子凝集是活动精子以各种方式，如头对头，尾对尾或混合型相互黏附在一起的现象。以分级方式报告，从1级(零散的，每个凝集＜10个精子，有很多自由活动的精子)、2级(中等的，每个凝集＜10～50个精子，存在自由活动精子)、3级(大量的，每个凝集＞50个精子，仍有一些自由活动精子)到4级(全部的，所有精子凝集，数个凝集又粘连在一起)。凝集的存在暗示存在抗精子抗体，需进一步实验证明，但不足以推断免疫因素导致不育。
图1-13-2 人类精子异常形态图
六、精液中其他有形成分检查
精液含有的非精子细胞成分，称为“圆细胞”，这些细胞包括泌尿生殖道上皮细胞、前列腺上皮细胞、白细胞和不成熟的生精细胞。正常人精液中圆细胞＜5×10 6/ml。
前列腺增生肥大者可见较多增大的前列腺上皮细胞。正常精液中白细胞主要是中性粒细胞，数量不应超过1×10 6/ml。过多提示感染，为白细胞精子症，见于前列腺炎、精囊炎和附睾炎等;精液中红、白细胞异常增多见于生殖道炎症、结核、恶性肿瘤等。药物或其他因素导致睾丸曲细精管受损时，精液中可出现较多生精细胞。精液中出现癌细胞，可为生殖系统恶性肿瘤的诊断提供依据。精液中可出现的其他有形成分包括结晶体、卵磷脂小体、淀粉样小体、脂滴等。
七、计算机辅助精液分析
传统的精液检查方法带有很大的主观性，检查结果可因操作人员的不同而出现较大差异，也无法对精子运动能力进行严格的量化，且不同实验室之间的检查结果可比性较小。随着技术的进步，计算机辅助精液分析( computer-aided semen analysis，CASA)系统和精子质量分析仪( semen quality analyzer，SQA)目前正逐步得到应用，其高效、客观、高精度的特点使其在精液检查方面具有一定的优势。
(一)计算机辅助精液分析系统
通过将显微镜与摄像机连接，跟踪和确定单个精子的活动，并根据设定的精子运动的位移、精子大小和灰度及精子运动的有关参数，利用计算机对采集到的图像进行动态处理分析，并报告结果。CASA系统既可定量分析精子浓度、精子活动率、精子活动力，又可分析精子运动速度和运动轨迹特征。
采用CASA系统对精液进行检查时，需注意以下几个问题:①精子浓度在( 20～50)×10 9/L的范围内时结果较理想，精子浓度过高，标本应当稀释，还应在培养基中加入牛血清白蛋白( 0.3g/L)和葡萄糖( 1g/L)，以防止因标本稀释而造成精子运动改变;精子浓度过低时应多检查几个视野;②计算精子活动率时，精子只有发生了一定的位移，CASA系统才认为是活动精子，而对原地摆动的精子则判定为不活动精子，其结果常低于实际结果;③CASA系统测定的是单个精子的运动参数，缺乏对精子群体的了解;④CASA系统识别精子的准确性易受到精液中细胞和颗粒物质的影响。
(二)精子质量分析仪
当光束通过液化的精液时，精液中精子的运动可引起光密度变化，其中，光密度变化包括频率和振幅的变化。通过检测光密度频率和振幅的变化量，即可对精子质量进行判断。频率和振幅的变化量越大，则精子质量越好;反之，则精子质量越差。SQA具有重复性好、客观性强、精密度高，操作简便等优点，可以客观、快速地对精液质量进行评价，但目前还不能完全代替显微镜检查。