Rh血型系统是输血医学中仅次于ABO系统的第二大血型系统。Rh血型系统常见的抗原有D和C、c、E、e五种，分别由 RHD基因和 RHCE基因编码，RhD和RhCE蛋白均是反复穿膜的蛋白质。使用相应的抗D、抗C、抗c、抗E和抗e五种血型试剂可以鉴定这些抗原。临床上，D抗原是Rh抗原中免疫原性最强的抗原，也是最具有临床意义的抗原，一般只作D抗原鉴定，凡带有D抗原者称为Rh阳性，不带D抗原者称为Rh阴性。采用常规血清学技术，中国汉族人群中Rh阳性比例约为99.7%，Rh阴性比例大约0.2%～0.4%。欧洲和北美白人Rh阳性率在82%～88%，大约95%的非洲黑人是D阳性。

本节以鉴定RhD抗原为例，介绍Rh血型试管法、玻片法和微量板法的鉴定方法，除这三种方法之外，Rh血型的鉴定也可用柱凝集法、酶法和聚凝胺法进行定型。利用Rh血型定型试剂中的IgM抗D血型抗体和红细胞在盐水介质中反应，有相应抗原的红细胞发生凝集，无相应抗原的红细胞不发生凝集，从而判断待检红细胞上所具有的RhD抗原。

抗凝或不抗凝的血液标本都可以用于Rh定型。红细胞可以悬浮于自身血清、血浆、盐水中或洗涤后悬浮于盐水中。

( 1) IgM抗D试剂。

( 2) 6%小牛血清白蛋白，或Rh对照试剂。

( 1)加1滴抗D到一洁净试管，并做好标记。

( 2)加1滴6%小牛血清白蛋白，或试剂厂商提供的Rh对照试剂到第二个洁净试管中，并标记。

( 3)分别加1滴2%～5%红细胞悬液到每支试管中。

( 4)轻轻混合，通常( 900～1000)×g离心15秒。

( 5)轻轻重悬细胞扣，检查凝集。

( 6)评价反应强度，记录试验管和对照管的试验结果。

( 1)抗D管凝集，对照管不凝集表明红细胞是RhD阳性。

( 2)对照管和抗D管均阴性，说明待测红细胞是RhD阴性结果。此时如果检测的是患者标本则可以认为是RhD阴性。但根据多数国际行业协会的标准，要求对献血者血样和孕妇血样需做进一步确认试验，以排除弱RhD抗原的存在。

( 3)对照管凝集则试验无效，可能需要移除红细胞上的IgM或IgG抗体。

( 1)适合的试剂包括低蛋白单克隆试剂和高蛋白多克隆抗D试剂。

( 2)本试验只是RhD血型鉴定的初检，确认RhD血型需进一步进行弱D鉴定。

( 3)玻片法、微量板法和柱凝集卡等方法也可用于RhD血型的初筛试验。但由于玻片法的灵敏度较低，一般很少在临床RhD鉴定中使用该方法。

用玻片法进行Rh定型时，待检红细胞悬液的浓度是40%～50%。

适合用于玻片法的低蛋白抗D试剂。

( 1)试验前，将洁净玻片预热到40～50℃。

( 2)加1滴抗D到一洁净的玻璃片或白瓷板凹孔中，并做好标记。

( 3)加1滴合适的对照试剂到另一洁净的玻璃片或白瓷板凹孔中，并做好标记。

( 4)向以上玻片上或白瓷板凹孔中的每一种试剂中分别加1滴充分混匀的40%～50%待检红细胞悬液。

( 5)充分混合抗体试剂和细胞，用搅拌棒将混合物均匀分散。

( 6)不断地从一边到另一边轻轻倾斜转动玻片或白瓷板，持续大概2分钟。

( 7)读取，解释并记录所有玻片或白瓷板凹孔中的结果。

( 1)抗D试剂与红细胞反应表现凝集，而对照为阴性反应，表明待检红细胞是RhD阳性。

( 2)抗D试剂与对照均为阴性反应，表明待检红细胞可能是RhD阴性，进一步使用试管法间接抗球蛋白试验可以检出玻片法检测不到的弱D表型。

( 3)如果对照反应阳性，在没有进一步试验之前，不能解释为RhD阳性。

( 1)玻片法可能存在感染性标本暴露的风险，需注意防范。

( 2)玻片法不适合检测弱D表型。

根据生产厂商的说明。自动化技术需要抗凝样本。

只使用获得许可，能用于微孔板检测的抗D试剂。参照生产厂商的说明，使用特定的试剂、仪器及正确的操作。

( 1)在干净的微孔板孔中加入1滴抗D试剂。如果该试剂需要使用Rh对照，在第2孔中加入1滴Rh对照。

( 2)在每孔中加入1滴2%～5%生理盐水红细胞悬液。

( 3)轻轻拍打平板的边沿，混匀各组分。

( 4)根据生产厂商的说明，使用合适的条件离心平板。

( 5)轻拍微孔板，或者使用机械摇板器，或者将板放置一定角度，使液体流动，以重悬红细胞。

( 6)检测凝集，判读、解释、记录实验结果。

( 7)为加强弱反应，将阴性结果的样本在37℃，孵育15～30分钟，重复步骤( 4)～( 6)。

( 1)抗D孔中出现凝集，同时，对照组中是均匀的悬液，说明该红细胞是D阳性。

( 2)抗D孔和对照孔中均未出现凝集。来自患者的样本可以被定为D阴性。

( 3)对于献血者的样本以及来自母亲产生Rh免疫球蛋白的婴儿样本，需进一步检测是否具有弱D抗原。

同玻片法和试管法。

已加抗D试剂的柱凝集血型卡。

( 1)配制好检测样本的红细胞悬液和试剂红细胞悬液。通常用于柱凝集试验的红细胞悬液浓度比试管法低，比如可选用1%或0.8%的红细胞盐水悬液50μl，个别新生儿卡中选用5%的红细胞盐水悬液10μl。

( 2)在柱凝集卡的RhD检测管中分别加入样本的红细胞悬液。

( 3)在专用柱凝集离心机中离心。

( 4)判读并记录凝集反应结果。

根据红细胞在凝胶柱内的反应情况解释凝集强度。出现凝集和(或)溶血结果为阳性，不凝集为阴性。柱凝集法凝集强度判读表见图1-5-1。

已报道有100多种 RHD等位基因编码的RhD蛋白带有氨基酸置换，导致了多种D抗原变异型，包括弱D、部分D和Del表现型。

携带弱D ( weak D)抗原的红细胞仍被归类为D阳性。弱D型红细胞与某些抗D试剂在盐水介质中不发生凝集，但在间接抗球蛋白试验中发生凝集。因此，当在盐水介质中发现红细胞与IgM抗D不凝集时，不应立即鉴定为RhD阴性，需进一步排除弱D型的可能。当献血者初筛检测为阴性时需进一步进行Rh阴性确认试验，以排除弱D，但是如果检测的是患者样本，则可不必再确认。

“部分D ( partial D)”，又称不完全D红细胞，是由于缺失D抗原的一部分抗原表位而得名。目前人们将部分D分类为D ^Ⅰ～D ^Ⅶ，每个表位中又有若干个亚类。部分D表型常常是由于 RHD和 RHCE形成杂交基因，导致RhD基因的部分片段被 RHCE基因替代，杂交基因编码的蛋白质丢失D抗原的部分表位。部分D表型的个体输入正常RhD阳性红细胞，有可能会产生抗D。有些部分D则与弱D类似，是由于 RHD基因编码的蛋白质发生氨基酸置换所致。这类“部分D”与“弱D”两者不同之处是弱D的氨基酸替代常常发生在RhD蛋白的细胞内区段或跨膜区，而部分D的氨基酸替代则发生在RHD蛋白的膜外区。

Del红细胞表达非常少的D抗原，常规的血清学定型试验无法检出，需通过更加敏感的吸收放散技术才能检测到。常规血清学诊断的Rh阴性个体中，有一部分实际上是Del表现型。亚洲人中Del占到Rh阴性的10%～30%;白种人Del的频率要少得多，仅有大约0.027%。

通常使用洗涤后的红细胞悬液，试管法悬液浓度皆为2%～5%，柱凝集法为0.8%或1%。

不是每一种抗D试剂都适用于Rh阴性确认试验。通常采用室温反应的单克隆IgM抗D，结合一种用于抗球蛋白试验的单克隆或多克隆IgG抗D，用来进一步检测弱D表现型。

1.抗D试剂。

2.6%小牛血清白蛋白，或Rh对照试剂。

3.抗人球蛋白试剂，多特异性或抗IgG。

4. IgG抗体致敏的红细胞。

试验流程应使用合适的对照。

1.加1滴抗D到一洁净的试管中，并做好标记。

2.加1滴6%小牛血清白蛋白，或试剂厂商提供的Rh对照试剂作为对照试剂到第二个洁净试管中，并标记。

3.向每支试管加1滴2%～5%的红细胞生理盐水悬液。

4.混匀并孵育测试管和对照管，通常在37℃孵育15～30分钟。

5.孵育后可以离心并轻轻重悬细胞扣，检查凝集。

6.用生理盐水至少洗涤细胞3遍。每次洗涤，通常( 900～1000)×g，离心1分钟。弃上清。

7.倒扣吸干剩余上清液后，加1滴或2滴抗人球蛋白试剂，或根据试剂制造商的要求加抗人球蛋白试剂。

8.轻轻混匀，并以校准的速度和时间离心，通常( 900～1000)×g离心15秒。

9.轻轻重悬，检查凝集强度并记录结果。

10.加入IgG致敏的质控红细胞以确认阴性抗球蛋白试验的有效性。

1.抗D管凝集，对照管没有凝集，表明红细胞是D阳性。将结果报告成D阳性，或者D变异型。

2.抗D管和对照管均没有凝集，则提示被检红细胞上无D抗原表达，是D阴性。

3.允许使用待检红细胞的直接抗球蛋白试验作为对照，但是在间接抗人球蛋白试验过程中，最好使用一种Rh或白蛋白对照试剂，可以排除所有试剂成分造成的假阳性。

4.对照管在任何阶段出现凝集，则试验无效。先从红细胞上移除IgG抗体可能对试验是有帮助的。

1.在临床输血中弱D型个体输注RHD阳性红细胞后可产生抗D抗体。所以受血者(患者)为弱D型，作Rh阴性论，应输注Rh阴性血液;供血者(献血者)为弱D型者，应作Rh阳性论，不应当输血给Rh阴性的受血者。

2.在选用IgM和IgG抗D试剂时，所选用的抗D应能尽可能多的识别不同D表位。其中D ^Ⅳ、D ^Ⅴ、D ^Ⅵ表位被认为是必须可识别的。

3.中国人RhD阴性群体中约有10%～30%的个体是Del表型。这类表型的个体在受到D抗原免疫刺激时，几乎不产生应答。Del表型的鉴定请参见本章第四节中吸收试验和放散试验。

4.对于“部分D”表型个体，由于缺失D抗原的一部分抗原表位，表现为与某些单克隆抗D不凝集而与另外的单克隆抗D试剂发生凝集。进一步鉴定其带有或缺失的RhD表位，需使用一组分别针对不同D表位的特殊抗D抗体。例如: DIAGAST公司的D-Screen试剂盒，是一组针对RhD蛋白不同表位的单克隆抗D试剂。有些部分D表型的个体，如D ^ⅥⅢ表型，可产生缺乏其表位的抗D抗体，D ^ⅥⅢ型妇女与Rh阳性丈夫生育的婴儿可能发生新生儿溶血病。