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第八节 纤溶系统的检验
一、优球蛋白溶解时间
【原理】
血浆经稀释后，加稀醋酸使pH降低至4.5时优球蛋白组分即沉淀，经离心可除去纤溶抑制物。而沉淀的优球蛋白组分中含纤维蛋白原、纤溶酶原和纤溶酶原激活物等。将此沉淀物溶解于缓冲液中，再加氯化钙(加钙法)或凝血酶(加酶法)使其凝固，置37℃下观察凝块完全溶解所需时间，即为优球蛋白溶解时间( euglobulin lysis time，ELT)。
【试剂与器材】
1.109mmol/L枸橼酸钠溶液。
2.1%醋酸溶液。
3.硼酸盐缓冲液( pH 9.0) 取氯化钠9g，硼酸钠1g，加蒸馏水溶解后，加水至1000ml。
4.0. 025mol/L氯化钙溶液。
【操作】
1.109mmol/L枸橼酸钠0.2ml，加1.8ml血液，混匀，并分离血浆。
2.尖底离心管1支，加蒸馏水7.5ml，加1%醋酸约0.12ml，使pH为4.5，置冰浴中。
3.取0.5ml血浆加到上述置冰浴中的离心管中，混匀，继续置冰浴中10分钟，使优球蛋白充分析出。
4.用3000r/min离心5分钟，倾去上清液，倒置离心管于滤纸上，吸去残余液体。
5.加硼酸缓冲液( pH 9.0) 0.5ml于沉淀中，置37℃水浴中，轻轻搅拌使之完全溶解。
6.加入0.025mol/L氯化钙0.5ml，开动秒表记录凝固时间。
7.置37℃水浴中，观察凝块完全溶解，并记录时间。
【参考区间】
溶解时间( ELT)大于120分钟。小于70分钟为异常，是诊断纤溶活性亢进的指标之一;大于120分钟提示纤溶活性减低。
【注意事项】
1.采血时止血带不宜扎得过紧，时间不得超过5分钟。
2.第2、3步骤要在15分钟内完成。
3.观察溶解标本以不见絮状物为准。
4.当纤溶极度亢进时，体内纤溶酶原基本被耗尽时，本试验可呈假阴性。
5. ELT测定依赖于血浆中有足够的纤维蛋白原和纤溶酶原，当血浆中优球蛋白浓度较低时，可能仅出现较纤细的纤维蛋白丝或无纤维蛋白凝块形成而影响测定，ELT可延长。肝素抗凝治疗不会影响ELT测定，因为肝素不会在醋酸溶液中发生沉淀。由于ELT的测定时间较长，影响因素多，近年来已较少在临床应用。
【临床意义】
本试验用以观察总的纤溶活性。当原发性或继发性纤溶亢进(如DIC)时，ELT缩短(小于70分钟有价值)。ELT＞120分钟，提示纤溶活性减低，临床意义不大。
二、纤溶组分检验
(一)组织型纤溶酶原激活剂活性测定( tissue plasminogen activator activity，t-PA: A) 【原理】
发色底物法。
【试剂与器材】
1.抗凝液。
2.浓酸化液 应用时每支用蒸馏水稀释到10ml。
3.浓缓冲液 应用时每支用蒸馏水稀释到25ml。
4.纤溶酶原。
5.发色底物S2251。
6.共价物。
7.标准品( 10U)。
8.终止液。
9.光电比色仪。
【操作】 1.标准曲线绘制
( 1) t-PA标准品用缓冲液4.0ml溶解，再稀释100倍(取50μl，加缓冲液4950μl)，此时t-PA标准品活性为2.5×10 －2U/ml，按表1-4-5加入到平底酶标板上。
表1-4-5 t-PA标准孔稀释
( 2)各用缓冲液2ml将发色底物、共价物、纤溶酶原溶解，然后予以混合，在各标准品孔中，每孔加100μl，湿盒中保温约150～180分钟(或标准系列中的6号管对应的测定孔的405nm吸光度值为0.8左右)。
( 3)加终止液20μl终止反应，在酶标仪上检测各孔405nm吸光度值，以标准系列中的1号管调零点(或在检测后减去该孔的值)。
( 4)以405nm吸光度值为纵坐标，t-PA: A为横坐标，绘制标准曲线。
2.检测
( 1) 0.129mol/L枸橼酸钠抗凝血浆200μl，即刻加等体积酸化液，立即混合，2～8℃可保存12小时，－20℃可保存1个月。检测前需摇匀。
( 2)用缓冲液将经酸化的待测血浆再稀释15倍 (取50μl，加缓冲液700μl，稀释倍数可根据血浆中t-PA: A的高低而增减)，用微量取液器取100μl加入到酶标板的检测孔中。
( 3)余同标准曲线绘制步骤( 2)与( 3)。
( 4)待测样品t-PA: A可从标准曲线上查出，结果乘以稀释倍数15×2×1.1即可(如果用固体肝素抗凝，则不用乘以1.1)。
【参考区间】
( 0.3～0.6) U/ml。
【注意事项】
1.因加压后t-PA可进入血液，采血标本时最好不用止血带;取血后尽快在低温下分离血浆。
2.样本必须加以酸化处理，以抑制纤溶酶原激活抑制剂( PAI)的作用。
3.血浆t-PA的影响因素较多，可随年龄的增加而升高;在剧烈运动、机体应激反应时增高。此外，血液标本采集时的状况(如压脉带的使用)、标本溶血、血浆中的其他抗体(如嗜异性抗体、类风湿因子)等可影响t-PA: Ag的测定结果。t-PA测定方法较多，而且缺乏标准化，不同实验室的报告方式和参考区间有显著不同，每个实验室应根据所使用方法建立各自的参考区间。
【临床意义】 1. t-PA活性增高
表明纤溶活性亢进，见于原发性和继发性纤溶亢进症( DIC等)。
2. t-PA活性降低
表明纤溶活性减低，见于血栓前状态和血栓病。
(二)组织型纤溶酶原激活剂抗原测定( tissue plasminogen activator antigen，t-PA: Ag) 【原理】
酶联双抗体夹心法。
【试剂与器材】
1.鼠抗人t-PA单抗。
2.包被液 0.05mol/L碳酸盐缓冲液( pH 9.6)。
3.辣根过氧化物酶抗体复合物。
4.基质 邻苯二胺( OPD)。
5.基质缓冲液 0.2mol/L枸橼酸，0.2mol/L枸橼酸钠缓冲液( pH 4.5)。
6.稀释缓冲液 0.49%白蛋白-0.01mol/L磷酸盐缓冲液( PBS-BSA，pH 7.4)。
7.洗涤液 0.025mol/L氯化钙-Tween-20-PBS缓冲液。
8.标准t-PA。
9.0. 13mol/L枸橼酸钠溶液。
10.30%过氧化氢溶液。
11.终止液3mol/L硫酸。
12.酶标仪。
【操作】 1.标准曲线绘制
( 1)用包被液稀释t-PA抗体后包板，每孔200μl，37℃温育过夜，次日用洗涤液洗3次，甩干。
( 2)将标准t-PA稀释成10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1.25μg/ml，0.625μg/ml，0.3125μg/ml，每孔加20μl (复管)，温育1小时后，用洗涤液洗3次，甩干。
( 3)用稀释缓冲液稀释辣根过氧化物酶抗体复合物到应用浓度，每孔加200μl，温育1小时，洗涤3次，甩干。
( 4)用基质缓冲液10ml溶解邻苯二胺( 1g/L)，加入30%过氧化氢溶液10μl (新鲜配制)后，即刻加入各孔，每孔200μl，显色10～15分钟。
( 5)目测为最佳显色时，每孔加3mol/L硫酸50μl，终止反应，于492nm处读取吸光度值，以稀释缓冲液调零点。
( 6)以吸光度为纵坐标，t-PA含量为横坐标制备标准曲线。
2.检测
( 1)枸橼酸钠抗凝血浆1份加稀释缓冲液5份，如果估计t-PA值增高，抗凝血浆可作1∶10稀释，每孔加样200μl。
( 2)余同标准曲线绘制中2～5。
( 3)据吸光度读数由标准曲线查得t-PA含量。
【参考区间】
1～12μg/L。
【临床意义】
见t-PA: A检测。
(三)纤溶酶原活性测定( plasminogen activity，PLG: A) 【原理】
发色底物法。
【试剂与器材】
1.发色底物S2251，用双蒸水配制成5g/L。
2.链激酶。
3.0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液( pH 7.4)。
4.正常混合血浆。
5.反应终止液: 50%的醋酸。
6.光电比色仪。
【操作】
1.将正常混合血浆用缓冲液进行1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀释，各稀释度取50μl加入96孔的酶标板中，将标本作1∶10稀释后加50μl于酶标板中。
2.每孔加50μl链激酶，37℃温育30分钟。
3.每孔加发色底物20μl及缓冲液100μl，置于微量振荡器上混合片刻。
4.37℃温育1小时，加50%醋酸50μl终止反应。
5.酶标仪上读取405nm的吸光度值。
6.以标准品中PLG的活性作横坐标( 1∶10正常人混合血浆为100%活性)，以405nm吸光度值作为纵坐标在半对数纸上绘制标准曲线。
7.以待测样品的吸光度值在标准曲线上查得PLG的含量，再乘以稀释倍数，从而得出待测标本的PLG活性值。
【参考区间】
( 85.55±27.83) %。
【注意事项】
从链球菌提取的SK，不能直接激活PLG，但可与PLG形成1∶1的复合物，使PLG结构发生改变，自身降解产生纤溶酶( plasmin)而水解发色底物显色。发色底物法测定PLG: A简便、快速，比免疫化学法更适用。除了少数患者外，PLG活性与抗原测定的相关性较好。由于血浆PLG水平受多种因素的影响而出现波动，不能灵敏地反映纤溶亢进。血浆PLG减低，可能是因PLG消耗而减低，也可能由于合成减少所致。测定血浆PLG的抑制物α 2-抗纤溶酶(α 2-antiplasmin，α 2-AP)比其更敏感。
【临床意义】
纤溶酶原活性减低，表明其激活物的活性增强，见于原发性纤溶、重症肝炎、肝硬化、肝叶切除、门静脉高压症、肝移植、大型手术、前置胎盘、胎盘早剥、肿瘤扩散、严重感染以及弥散性血管内凝血等。
(四)纤溶酶原激活抑制剂-1活性测定( plasminogen activator inhibitor-1 activity，PAI-1: A) 【原理】
发色底物法。
【试剂与器材】
1.抗凝液。
2.浓缓冲液 使用前用蒸馏水作1∶24稀释。
3.纤溶酶原。
4.共价物。
5.发色底物。
6.标准品( 10.0U)使用前用缓冲液稀释为t-PA: A 5.0×10 －2U/ml。
7.终止液。
8.酶标仪。
【操作】 1.标准曲线绘制
( 1)取活性为5.0×10 －2U/ml t-PA 500μl，加等量缓冲液混匀，使t-PA活性为2.5×10 －2U/ml。此时PAI-1相对活性为0任意单位( arbitrary，AU)。任意单位，为PAI-1活性单位，其定义为在25℃，20分钟内抑制1.0U t-PA的PAI酶量，即为1.0AU，按表1-4-6加入到平底酶标板上。
表1-4-6 制作PAI相对活性标准曲线稀释法
( 2)各用缓冲液2ml将发色底物、共价物、纤溶酶原溶解，然后予以混合，混合后加入上述孔中，每孔100μl，将板置湿盒中保温约150～180分钟(或3号孔405nm吸光度值为0.8左右)。
( 3)在酶标仪上检测各孔405nm吸光度值，用1号孔调零点(或在检测后减去该孔的值)。
( 4)以405nm吸光度值为纵坐标，PAI相对活性为横坐标，绘制标准曲线。
2.检测
( 1)待测血浆用缓冲液稀释20倍(取50μl，加缓冲液950μl)，然后取200μl，与等量活性为5.0× 10 －2U/ml的标准t-PA混合，25℃放置20分钟，用微量吸液器取100μl加入到酶标板的余孔中。
( 2)余同标准曲线绘制步骤2～3。待测样品PAI活性可从标准曲线上查出，乘以40，再乘以1.1 (抗凝剂与静脉血1∶9稀释)即可。
【参考区间】
0.1～1AU/ml。
【注意事项】
1.试剂一旦溶解应一次用完。
2.本法的线性范围为0.005～0.025AU/ml，若标本检测值不在此范围，可视显色深浅调整稀释度。
3.保温时间可视标准品的显色程度作适当选择。
4.血浆标本于－20℃中可保存1个月。
【临床意义】
1. PAI-1活性增高 见于高凝状态和血栓性疾病。
2. AI-1活性降低 见于原发性和继发性纤溶症。
(五)纤溶酶原激活抑制剂-1抗原测定( plasminogen activator inhibitor-1 antigen，PAI-1: Ag) 【原理】
酶联双抗体夹心法。
【试剂与器材】
1.6×16预包被鼠抗人纤溶酶原激活物抑制剂-1 ( PAI-1) IgG抗体的微量测试排条。
2. PET缓冲液( PBS-EDTA-Tween-20缓冲液)。
3. PAI-1血浆标准品“50”( 50ng/ml)，0.5ml。
4. PAI-1血浆标准品“0”(缺乏PAI-1血浆)，0.5ml。
5.标记抗体 过氧化物酶标记的羊抗人PAI-1 IgG抗体。
6.酶标仪。
【操作】 1.试剂准备 ( 1) PET缓冲液:
溶解PET缓冲液于1L净水中，搅拌15分钟，2～8℃可保存1个月。
( 2)终止液( 4.5mol/L H2SO4) :
将5ml 95%～97%的H 2SO 4加至15ml水中，混匀。
( 3) PAI-1血浆标准品:
加0.5ml水至含PAI-1血浆标准品“50”的瓶中(轻轻振荡3分钟)，配成50ng/ml PAI-1。加0.5ml水至含PAI-1血浆标准品“0”的瓶中(轻轻振荡3分钟)，配成PAI-1为0血浆( 0ng/ml)。PAI-1标准品“50”和“0”也可用小的加塞试管分装，保存于－20℃或温度更低处。
( 4)标记物:
加7ml PET缓冲液至标记物瓶中，轻摇3分钟，2～8℃可保存1个月。
( 5)底物:
一片基质溶解于3ml水中，再加21ml水至24ml，可分装成每瓶4ml，－20℃可保存1个月。
2.检测
( 1)取出适 量微量测试排条并安置于托板上，其余的重新封存好。用PET缓冲液洗去所用排条中的防腐剂。
( 2)制备PAI-1血浆标准品:按表1-4-7比例加PAI-1标准品“50”( 50ng/ml)和PAI-1标准品“0”(缺乏PAI-1血浆)，混匀。
表1-4-7 标准曲线的制作
( 3)制备血浆样本: 0.129mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝的缺乏血小板血浆，可在－70℃保存2年。一般无需稀释血浆，仅在PAI-1大于50ng/ml时，可用PAI-1标准品“0”(缺乏PAI-1血浆)稀释，或用缺乏t-PA/PAI血浆稀释。
( 4)样本加法:在第一列各孔加20μl对照血浆，剩余的孔可加等量待测样本，25℃放置1小时，置摇床混匀( 400～500r/min)。
( 5)标记物:每孔加50μl标记液，25℃放置1小时，置摇床混匀( 400～500r/min)。
( 6)洗涤:用PET缓冲液洗涤，放置3分钟，甩干，重复洗板4次。
( 7)底物:如果用24ml底物，可在用前加10μl 30% H 2O 2至底物中，混匀。如用分装品，则在4ml底物中加3～5μl 30% H 2O 2(均需用前新鲜配制)。每孔加200μl底物/H 2O 2混合液，置25℃摇床11～12分钟。
( 8)终止:加50μl终止液终止反应。
( 9)在波长492nm处检测吸光度值。
3.标准曲线绘制
以PAI-1: Ag含量( ng/ml)为横坐标，相应492nm处吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
【参考区间】
人PPP中PAI-1: Ag含量为4～43ng/ml［平均( 18±10) ng/ml］。
【注意事项】
1.本法可用于检测血浆、组织液、细胞培养上清液中PAI-1: Ag含量。
2.须用缺乏血小板血浆样本，否则将影响检测结果。
3. PAI-1水平在一天中以15时最低，在采集样本时应注意这一点。
4.该法可检测活化和非活化形式的PAI-1，t-PA/PAI-1和u-PA/PAI-1复合物。
5.防腐剂(叠氮化钠)可抑制过氧化物酶的活性，因此在加标记物前应用PET缓冲液洗净每孔。
6. PAI释放有明显的昼夜节律性，早晨最高、下午最低。一般在上午8～10时采血较为适宜，而且采血前患者应休息20分钟以上，尽量减少t-PA释放，以免影响PAI测定。血浆中的PAI主要包括PAI-1和PAI-2，前者含量较高，一般主要检测PAI-1。PAI的测定方法较多，而且缺乏标准化，不同实验室的报告方式和参考范围有显著不同，每个实验室应根据所使用方法建立各参考范围。由于t-PA和PAI是一对体内最重要的纤溶活性调节剂，同时测定两者更有意义。
【临床意义】 1. PAI-1抗原含量增高
见于深静脉血栓、心肌梗死和败血症等。在正常妊娠后期，PAI-1: Ag含量可呈3～6倍增高。
2. PAI-1抗原含量降低
见于原发性和继发性纤溶。
(六)α2-抗纤溶酶活性测定(α2-antiplasmin activity，α2-AP: A) 【原理】
发色底物法。
【试剂与器材】
1.纤溶酶。
2.发色底物S2251。
3.标准血浆 20个以上的正常人混合血浆。
4.终止液 2mol/L的硫酸。
【操作】
1.将标准血浆稀释10倍，设此时α 2-AP活性为200%，按表1-4-8加入到酶标板上。
表1-4-8 制作α2-AP标准曲线稀释法
2.将代测标本用缓冲液作20倍稀释，取100μl加入到酶标板中，37℃保温10分钟。
3.将发色底物及纤溶酶分别用1ml缓冲液溶解，37℃保温30分钟。
4.吸取50μl纤溶酶加入到待测标本中，37℃准确保温2分钟。
5.吸取50μl发色底物加至上述孔中，混匀，置室温1分钟左右，加终止液20μl，检测405nm吸光度值。
6.以405nm吸光度值为纵坐标，以α 2-AP: A为横坐标，绘制标准曲线。
7.以待测标本的405nm吸光度值在标准曲线上查出α 2-AP: A，再乘以稀释倍数就得到标本的α 2-AP: A。
【参考区间】
( 95.6±12.8) %。
【注意事项】
1.试剂溶解后应一次用完。
2.样本稀释度，视显色深浅可作适当调整。
3.底物的作用时间应根据标准曲线各孔的显色程度来决定。
4.所有试剂都必须新鲜配制。
5.血浆α 2-AP的含量通常较为恒定，α 2-AP比纤溶酶原测定能更灵敏地反映纤溶活性。对于一些伤口愈合慢，出血时间延长，PT、APTT正常的患者，可能是由于α 2-AP缺乏所致。
【临床意义】 1.α2-AP:
A升高 见于动脉和静脉血栓形成、产后、恶性肿瘤等。
2.α2-AP:
A降低 见于肝病、手术后、弥散性血管内凝血、先天性α 2-AP缺乏症。
(七)纤溶酶-抗纤溶酶复合物测定( plasminantiplasmin complex，PAP) 【原理】
酶联双抗体夹心法。
【试剂与器材】
1.12×8孔预包被可拆式反应条。
2. PAP冻干标准品。
3.缺乏PAP血浆。
4.标记有辣根过氧化物酶的抗人纤溶酶原抗体。
5. ABTS底物12ml。
6.终止液12ml。
7.洗涤缓冲液( 20ml，12.5倍浓缩液)。
8.稀释液( 20ml，2.5倍浓缩液)。
9.酶标仪。
【操作】 1.试剂准备
使用前将试剂置于室温中。
( 1)洗涤缓冲液:
20ml浓缩液加入230ml蒸馏水稀释。
( 2)稀释缓冲液:
20ml浓缩液加入30ml蒸馏水。
( 3)检测抗体:
加入1.2ml稀释液，混匀，变成10倍浓缩液。若一次不能全部用完，则将剩余的分装为每份100μl，－20℃冻存。再次使用前37℃融化后应用。
( 4)缺乏PAP血浆:
每瓶加入1.1ml蒸馏水溶解，放置15分钟，混匀。
( 5) PAP标准品:
加入0.1ml蒸馏水，15分钟静置，混匀。
( 6) PAP低水平曲线( A) :
13.5ml稀释缓冲液中加入1.5ml缺乏PAP血浆，即稀释液A。
( 7) PAP高水平曲线( B) :
49.5ml稀释缓冲液中加入0.5ml缺乏PAP血浆，即稀释液B。如表1-4-9所示，用稀释液A或稀释液B制备系列浓度的PAP标准品。
表1-4-9 标准曲线制作
2.标本制备
全血用0.129mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝［含有终浓度为2000kU/ml抑肽酶和20mmol/L的苯甲脒( benzamidine)］，4℃条件下，5000×g离心10分钟，90分钟内收集血浆，－70℃冻存，使用前37℃快速融化。患者血浆用稀释液A作1∶10稀释(低水平PAP)或者用稀释液B作1∶100稀释(高水平PAP)进行检测。
3.检测
( 1)打开银箔袋，撤去酶标板的框架。将不用的板条依旧包好，封紧后重新置2～8℃贮存。
( 2)用洗涤缓冲液洗板4次。
( 3)每孔加100μl标准品或稀释血浆标本，并同干净塑料膜封板，在4℃条件下过夜。所有检测均做复管检测。
( 4)用洗涤缓冲液洗板4次。
( 5)将酶标抗体用稀释液按1∶10比例稀释并混匀。每孔加100μl，37℃温育2小时。
( 6)用洗涤缓冲液洗板4次。
( 7)每孔加100μl底物溶液，室温温育30分钟。
( 8)每孔加100μl终止液，将酶标板放入酶标仪，于405nm处在1小时内读取吸光度值。
4.标准曲线绘制
以吸光度平均值与对应的PAP标准品浓度绘制标准曲线。稀释标本PAP浓度可从标准曲线上直接查到，此值乘以稀释倍数，即可获得患者血浆中PAP的浓度。标准曲线应每次制备。
【参考区间】
0～150ng/ml。
【注意事项】
1.试剂盒仅用于PAP测定，不可用于游离纤溶酶原、α 2-抗纤溶酶(α 2-AP)或其他纤溶酶复合物的检测，本检测也不受上述物质的干扰。
2.酶标板，浓缩液和冻干品应2～8℃保存，配好的稀释液2～8℃保存不超过1个月。冻干品复溶后置于－20℃冷冻可保存3周。
3.血浆α 2-AP的含量通常较为恒定，α 2-AP比纤溶酶原测定能更灵敏地反映纤溶活性。对于一些伤口愈合慢，出血时间延长，PT、APTT正常的患者，可能是由于α 2-AP缺乏所致。
【临床意义】
用于高纤溶酶血症和溶栓治疗的临床检测。α 2-AP在溶栓治疗过程中被消耗。PAP复合物的检测结果可了解纤溶酶血症的程度和出血的可能性。伴随纤维蛋白形成增加和高纤溶酶血症的疾病，PAP复合物含量也增加。所以，对于许多疾病，纤维蛋白降解产物的水平和PAP的水平呈正相关。除溶栓治疗外，一旦PAP浓度高于150ng/ml，则可视为血栓形成倾向或预示纤溶亢进。
三、纤维蛋白(原)降解产物检验
(一)血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验( 3P试验，凝固法) 【原理】
在凝血酶作用下，纤维蛋白原释放出肽A肽B后转变为纤维蛋白单体( FM)，与纤维蛋白降解产物( FDP)形成可溶性复合物。硫酸鱼精蛋白可使该复合物中FM游离出来，后又自行聚合呈肉眼可见的纤维状、絮状或胶冻状，它反映了FDP (尤其是碎片X)的存在。
【试剂与器材】
1.109mmol/L枸橼酸钠溶液。
2.10g/L硫酸鱼精蛋白溶液( pH 6.5)。
【操作】
1.取0.5ml贫含血小板的枸橼酸抗凝血浆( PPP)放入试管中。
2.置37℃水浴中3分钟。
3.加10g/L硫酸鱼精蛋白溶液0.05ml，混匀，置37℃水浴中15分钟，立即观察结果。
【结果判断】 1.阴性
血浆清晰不变，无不溶解物产生。
2.阳性
血浆中如有细或粗颗粒沉淀出现、或有纤维蛋白丝(网)或有胶冻形成。
【参考区间】
正常人为阴性。
【注意事项】
1.本试验不能用草酸盐、肝素或EDTA盐等作抗凝剂。
2.抽血不顺利、抗凝不完全、标本保存于冰箱、到时未立即观察结果等均会导致假阳性结果。
3.若水浴温度太低或纤维蛋白原的含量过低都会造成假阴性结果。
4.3P试验检测血浆中FDPs的灵敏度为＞50mg/ L，主要反映血浆中可溶性FM和FDPs中的较大的片段( X片段)增多，只有二者同时存在时3P试验才呈阳性。
5.采血后及时送检，可以避免假阳性结果。
【临床意义】 1.3P阳性
见于DIC早期或中期，但在大出血(创伤、手术、咯血)或样本置冰箱后可呈假阳性。
2.3P阴性
见于DIC晚期和原发性纤溶症。
(二)凝血酶时间( TT)测定 【原理】
在凝血酶作用下，待检血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白。当待检血浆中抗凝物质增多时，凝血酶时间延长。
【试剂与器材】
1.109mmol/L枸橼酸钠溶液。
2.凝血酶溶液 可将浓凝血酶液加生理盐水，直至正常人对照血浆的凝固时间为16～18秒。
3.秒表。
【操作】
1.取待检枸橼酸钠抗凝血浆0.1ml，置于37℃水浴中温育5分钟。
2.加入凝血酶溶液0.1ml，记录凝固时间。如此重复2～3次，取平均值。
【参考区间】
16～18秒，若超过正常对照3秒以上者为异常。
【注意事项】
1.采血后宜在1小时内完成检测，血浆标本置冰箱保存不应超过4小时。
2.肝素或EDTA-Na 2抗凝血浆不宜作本试验。
3.当血浆中纤溶酶活性增高，导致纤维蛋白/纤维蛋白原降解产物( FDP)增加时，可使TT明显延长，故TT是一项常用的纤溶活性筛选试验。然而，TT的长短与血浆中纤维蛋白原的浓度、结构和凝血酶抑制物等抗凝血酶的物质存在密切相关，故TT还可用于低/异常纤维蛋白原血症和类肝素物质增多的筛查。
4. TT测定时，所加入血浆的凝血酶试剂的浓度对其结果影响极大，将对照血浆的TT值调在16～18秒，再测标本较为合适。
【临床意义】 1.凝血酶时间延长
见于肝素增多/类肝素抗凝物质存在，纤维蛋白(原)降解产物( FDP) /D-D增多以及低(无)纤维蛋白原血症异常纤维蛋白原血症等。
2.凝血酶时间缩短
常见于血样本有微小凝块或钙离子存在时。
(三)血清纤维蛋白(原)降解产物［fibrin ( gen) degradation products，FDP］定性试验 【原理】
胶乳凝集法。
【试剂与器材】
1.鼠抗人FDP单抗包被的胶乳颗粒悬浮液。
2.甘氨酸缓冲液。
3. FDP阴性对照液。
4. FDP阳性对照液。
5.专用纸片板。
6.混匀用塑料小棒。
【操作】
1.待测样本需先作两个稀释度，1∶2 (血浆50μl加甘氨酸缓冲液50μl)，1∶8 (血浆50μl加甘氨酸缓冲液350μl)，混合。
2.每个稀释度各取20μl，加于纸片板的相邻环行圈内。
3.阳性对照、阴性对照各取20μl于各自环行圈内。
4.每个环行圈内各加经摇匀的单抗胶乳悬液20μl。
5.每圈取一根混匀用小棒，将两液混合，然后轻巧地旋转纸片板3分钟。
6.观察结果 待测样本与阳性、阴性对照比较，若两个稀释度均与阴性对照一样不产生凝集，则FDP值小于5mg/L;若1∶2出现凝集而1∶8不凝集，则FDP在5～20mg/L;若两个稀释度均与阳性对照一样产生凝集，则FDP值大于20mg/L。
本法的FDP检测阈值为2.5mg/L。超过1∶8阳性时，则检测值为大于2.5×8 (稀释倍数)。
【参考区间】
小于5mg/L。
【注意事项】
1.试剂储存于2～8℃，用前取出置于室温中。
2.包被抗体的乳胶悬液，每次用前需处于充分混悬状态。
3.待测血浆用109mmol/L枸橼酸钠抗凝，以3000r/min离心15分钟。保存时间: 20℃8小时，2～8℃24小时，－20℃1个月。
4.当类风湿因子强阳性存在时，可产生假阳性反应。
5. FDPs增高，间接反映纤溶活性亢进，可作为纤溶活性的筛查指标之一，具有较高的灵敏度。临床可用手工胶乳凝集试验半定量检测FDPs，该法较为简便，适合于少量标本测定。目前，已经有在全自动凝血仪上使用的乳胶凝集免疫比浊法试剂，使检测的速度和敏感性有较大的改善。
【临床意义】
1.原发性纤溶亢进时，FDP含量可明显增高。
2.高凝状态、弥散性血管内凝血、肺栓塞、器官移植的排斥反应、妊娠期高血压疾病、恶性肿瘤、心、肝、肾疾病及静脉血栓、溶栓治疗等所致的继发性纤溶亢进时，FDP含量升高。
(四) D-二聚体( D-dimer，D-D)测定 【原理】
酶联双抗体夹心法。
【试剂与器材】
1.已包被抗体的酶标板。
2.酶标抗体。
3.酶抗体反应助剂，使用前与酶标抗体等量混合。
4.样品稀释液。
5. D-二聚体标准品。
6.洗涤液。
7.底物 邻苯二胺，临用前加底物缓冲液2ml、蒸馏水3ml，加30%过氧化氢溶液4μl。
8.底物缓冲液。
9.30%过氧化氢溶液。
10.终止液。
11.酶标仪。
【操作】 1.标准曲线绘制
( 1)标准品用样品稀释液0.5ml精确复溶。
( 2)将已包被有抗体的酶标板揭去封口膜后，倾去保护液并用洗涤液洗涤1次，甩干。
( 3)在酶标板的右侧两排孔11A～H、12A～H中，11A、12A、11B、12B加标准品各100μl。用样品稀释液(各孔100μl)，从11B、12B开始按倍比稀释法进行连续稀释(每一稀释度都是双孔)至11H、12H，每孔最终体积为100μl，37℃温育1.5小时。
( 4)甩去液体，用洗涤液洗4次。
( 5)加酶标记D-二聚体单抗，每孔100μl，温育30分钟。
( 6)甩去酶标抗体，洗涤4次，拍干。
( 7)加底物，每孔100μl，37℃温育15分钟。
( 8)每孔加终止液50μl，于495nm波长读取吸光度值，空白对照孔调零点。
( 9)在半对数坐标纸上，以D-二聚体含量为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。
2.检测
( 1)检测孔每孔加90μl样品稀释液、10μl待测样品，加毕轻轻振荡酶标板，使混合均匀。37℃温育1.5小时。
( 2)余同标准曲线绘制步骤( 4)～( 8)。
( 3)用样品孔双孔吸光度的平均值，查曲线得D-二聚体含量，乘稀释倍数获最初含量。
【参考区间】
0～0.256mg/L。
【注意事项】
1. D-D的检测方法有多种，主要是基于胶乳凝集原理的定性或半定量试验以及基于ELISA原理的定量测定，也有一些方法采用免疫浊度原理或免疫荧光原理。对于基于胶乳凝集原理的快速检测方法来讲，敏感度低是其最大的缺点，且由于其结果判断以阴性和阳性表示，无法通过降低临界值水平来提高敏感性。另外，由于结果需肉眼观察，不可避免地存在不同观察者之间的差异。现在已经发展了数种快速的、可检测单份标本的高灵敏度检测方法。
2. D-D是继发性纤溶亢进诊断的重要依据，是机体活动性血栓形成的特异性分子标志物。其报告的两种形式DDU和FEU之间不能转换。由于各种试剂所检测的抗原决定簇的差异，不同试剂间结果的差异显著。由于其检测敏感性高，特异性低，故是排除血栓性疾病尤其是静脉血栓最常用的指标，但要注意用于排除静脉血栓栓塞症的试剂敏感度和阴性预测值应符合要求，且试剂应有临界值标示并经产品注册审批部门审核批准。
3.较为理想的D-二聚体检测方法应该具有以下特点:①可以定量检测;②具有较高的敏感性和阴性预测值;③具有较好的可重复性;④结果处于临界值水平时的变异系数低;⑤方法简便，快速。ELISA可准确定量D-D，但操作步骤多、耗时长，临床较少用。目前临床多用乳胶凝集免疫比浊法在全自动血凝仪上进行定量检测。
4. D-二聚体参考区限的限定对于静脉血栓形成的排除诊断至关重要。传统的以正常人群测定结果分布的95%置信区间作为参考区限的方法对临床帮助不大。应以可获得深静脉血栓形成诊断最佳敏感性或阴性预测值作为临界值的判断指标。各实验室应该以对疑诊深静脉血栓形成的患者经过客观影像学检验证实的临床研究中确立针对该特定检测方法和特定人群的检测界限。手术后、肿瘤、妊娠、产后和高龄人群均可以出现D-二聚体的水平增高，这些情况下对深静脉血栓形成的阴性排除值应该单独设定。当D-二聚体值检测目的为排除VTE时，若排除VTE阈值与参考区间上限值不同，最好报告阈值。当不明确D-二聚体检测的原因或需要评估临床疾病时，建议同时报告参考区间及阈值。
5. D-D阴性患者(假阴性)，仍有极少数患者(＜2%)伴静脉血栓，其原因:①血栓体积很小/远端小血栓;②放射线/超声检查出现假阳性;③临床表现与标本采集时间相隔太长;④纤溶活性降低。
6.随着妊娠期的发展，孕妇的D-D值随之逐渐升高，可高至基础值的3～4倍。故结果判断时尤其要引起注意。妊娠期发生VTE，可干扰D-D排除VTE的有效性。若D-D结果阴性，仍有排除VTE的价值。
7. D-D检测对抗凝治疗的监测 抗凝治疗过程中( 3～6个月)，D-D值逐渐减低。若停用抗凝剂，D-D值水平正常则对复发VTE有较高的阴性预测值( NPV)，所以D-D检测对监测抗凝治疗有指导意义。
【临床意义】
1. D-二聚体是交联纤维蛋白降解中的一个特征性产物，在深静脉血栓、肺栓塞、弥散性血管内凝血、重症肝炎、肺栓塞等疾病中升高。
2.也可作为溶栓治疗有效的观察指标。
3.陈旧性血栓患者D-二聚体并不升高。
4.凡有血块形成的出血，本试验均可阳性，故其特异性较低。