干细胞再生心肌最令人关注的问题是移植细胞在心肌微环境中能否分化为心肌细胞和血管结构，进而改善心功能及预后。传统观点认为哺乳动物心肌细胞自出生后没有再生能力，病理状态下残余的心肌细胞通过细胞肥大来代偿心功能。但近期研究发现正常成人心脏中14/100万心肌细胞处于有丝分裂状态，AMI后处于分裂状态的心肌细胞可增加38.2倍，不过这种分裂能力极其有限。另外实验研究表明人外周循环血以及骨髓中的干细胞，在AMI、CHF等病理状态下相应增多，体外实验证实骨髓细胞三大主要干细胞组分：HSCs、MSCs和EPCs均能分化成心肌细胞或心肌样细胞。Tomita等也证实骨髓MSCs体外经5-氮胞苷诱导分化成有肌管样结构、表达肌钙蛋白I和肌球蛋白重链的心肌样细胞，标记后直接注入冻死心肌瘢痕中，8周后左室收缩功能改善，心肌瘢痕中有标记阳性的心肌细胞，并有大量新生血管网形成。Jackson等对经致死放射剂量照射的小鼠移植Lac-Z转染的骨髓细胞，移植10周后结扎左前降支冠脉60分钟制备成心肌梗死模型。梗死后2～4周发现梗死区0.02%心肌细胞和1%～2%血管内皮细胞呈Lac-Z阳性，说明骨髓干细胞能定向迁移至梗死区并分化成心肌细胞和血管内皮细胞。证明干细胞无论是体外诱导还是在梗死心肌中，均能横向分化为心肌细胞和血管，为干细胞应用于心肌再生的研究提供了证数支持。

Strauer等首开人类骨髓单个核细胞（mononuclear cells，MNCs）经冠脉内输注移植治疗AMI的先河，他们选择10例AMI患者，在接受标准治疗同时，于急诊经皮冠状动脉介入术（percutaneous coronary intervention，PCI）后1周，选择性将骨髓MNCs移植到梗死相关冠脉，随访3个月，结果表明移植组较对照组室壁运动障碍的面积减小20%，心肌灌注缺损面积显著减小，射血分据、心指据及心输出量均升高。2003年，Perin等报道了利用NOGA系统经心内膜对14例因严重心肌缺血导致CHF的患者心肌内注射自体骨髓干细胞，术后4个月随访显示，移植组较对照组左室射血分据（left ventricular ejection fraction，LVEF）增加9%，而左室舒张末容积（end-diastolic volume，EDV）显著减小。这两组小样本临床试验初步提示自体骨髓干细胞移植治疗缺血性心脏病的临床可行性及有效性。

迄今已有多种干细胞在动物实验和临床试验中被用于移植治疗心血管疾病，但是哪一种才是最佳尚没有定论。每一种干细胞均有其优劣，但相关的比较研究很少。理想的供体细胞应符合伦理要求，同时最好是自体组织来源，从而避免移植排斥反应。

因BMCs和MNCs中细胞含量丰富，尤其含有多种干细胞类型，如HSCs、EPCs和少许的MSCs，同时具有取材方便、获得的细胞据多、制备简单、无须体外扩增的优势，故广受欢迎。鉴于这些优势，BMCs 或MNCs已成为目前临床试验中最常用的供体细胞，其最长临床随访已达5年。

CD133+和CD34+是HSCs最常用的单标记，有研究提示从MNCs中分选CD34+细胞可进一步提高再生心肌的效能。

CD133+细胞：与CD34+细胞相比，CD133+细胞是更早且不成熟的细胞，尚未进入系决定阶段。一项小样本非随机研究显示，AMI后经冠脉输注CD133+细胞，4个月后LVEF显著改善，伴随灌注缺损面积的减小。然而，细胞移植组有更多的冠脉事件，如支架闭塞和支架内再狭窄。作者进一步报告，罪犯冠脉呈现时间依赖性的负性重构，管腔丢失加速，通畅性下降。然而，一项小样本非随机研究表明，在新近AMI的患者施行搭桥术中，经桥血管局部注射CD133+细胞，未发现不良事件，且室壁运动、灌注和心肌存活显著改善。Stamm等报告，在陈旧性心肌梗死（OMI）患者，经心外膜心肌内输注CD133+细胞至梗死边缘，不良事件并未增加，安全可行，左室功能改善显著，但该研究缺乏对照组，从而限制了其说服力。

CD34+细胞：与CD133+相比，CD34+细胞包含更多的内皮系决定性细胞，因此认为是富含早期EPCs的细胞群。在REGENT研究中，纳入LVEF<40%的AMI患者，经冠脉输注BMCs 或CD34+/CXCR4+细胞，6个月后，BMCs组LVEF增加3%，CD34+/CXCR4+组也增加3%，对照组不变。两种细胞组的LVEF绝对改善幅度无显著差异。另一项研究表明，BMCs移植在心功能受损严重的患者中获益更加显著。Losordo等研究显示，心肌内注射CD34+细胞治疗慢性心绞痛，6个月后心肌灌注显著改善。ACT34-CMI研究也证实这一结论。

骨髓主要包括HSCs和非造血细胞。非造血细胞充当HSCs在骨髓腔中的生长微环境，包含内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和MSCs。Friedenstein等于1970年发现MSCs在特定条件下可以分化成多种中胚层来源的细胞，故又称之为“成纤维细胞样克隆形成细胞（clony-forming units-fibroblast，CFU-F）”。随后研究发现在脐带血、外周血、胎肝、皮肤真皮层，甚至软骨中也存在MSCs。由于取材方便、可自体移植且不存在伦理争议，骨髓已经成为MSCs的最常见来源。MSCs只占骨髓中MNCs含量的0.001%～0.01%，大部分MSCs处于静止期（G0/G1），只有约10%处于增殖期，提示MSCs有强大的分裂增生潜能。

目前对于MSCs的表面标记尚没有一致看法，比较相近的认识是MSCs不表达分化相关的标记如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原和碱性磷酸酶，也不表达HSCs的标记CD34和CD45。目前已证实的MSCs表面标记有SH-2、SH-3、SH-4、SB-10、CD29、CD71、CD90、CD10b、CD120a、CD124、CD166等，人MSCs还表达Stro-1。离体和在体研究均表明MSCs可横向分化为心肌细胞。因为MSCs在体外可大量扩增，还可分泌抗炎因子和抗凋亡因子，这些显著优势使得其有望作为异体供体细胞的首选。

MSCs再生心肌的临床资料较少，在一项随机双盲对照Ⅰ期研究中，AMI后静脉注射同种异体MSCs，6个月随访时并未产生安全性方面的事件，且症状显著减轻。在早期研究中，MSCs经静脉注射，但因其体积较大，通过肺可能存在困难。有两项临床研究评价AMI后经冠脉输注MSCs，Chen等经冠脉输注高剂量（6×10 ¹⁰）MSCs，LVEF显著改善，而随后该小组应用低剂量MSCs（5×10 ⁶）并未改善缺血性心肌病患者的心功能，但MSCs移植3个月后运动耐量和心衰症状有所改善。

脂肪组织也能分离出MSCs，两项临床研究APOLLO和PRECISE正在探讨移植脂肪MSCs治疗AMI或OMI的安全性、可行性和有效性。

内皮细胞系与造血细胞系具有同源性，它们共同来源于中胚层的成血液血管母细胞（hemangioblast）。成年外周血中的AC133+细胞可沿着内皮细胞和造血细胞两条路线分化，说明出生后体内也存在EPCs。因缺乏特异的表面标记，对EPCs的鉴定标准尚未完全统一，目前将CD34、VEGF受体2、AC133作为相对特异的标记组合来筛选EPCs。

无论是体外还是在体移植实验均表明EPCs具有无可争辩的血管再生能力，这是EPCs用于治疗缺血性疾病的最大优势。新近研究显示EPCs可横向分化为心肌细胞，从而为EPCs用于心肌再生提供了新的理论基础。

在成年动物的造血组织中，HSCs据量极少，约占骨髓MNCs的0.5%。HSCs是不均一的细胞群，能分化形成多系定向祖细胞、红细胞、粒-单核系祖细胞、巨核系祖细胞和T/B淋巴系祖细胞，并进一步形成各类终末血细胞释放入外周血循环。目前认为HSCs表面标志是CD34+/CD45+/AC133+/Sca-1+，研究表明HSCs还能横向分化为非造血细胞，如破骨细胞、肥大细胞和表皮细胞等。

Jackson等率先发现HSCs移植后在梗死心肌边缘可以获得心肌表型，关于HSCs的成心肌分化能力也为Orlic等证实。相反，有研究发现HSCs在心脏中不能分化为心肌细胞，在所有观察时点，供体细胞始终表达造血细胞标志。因此就HSCs在心肌再生中的实际作用和机制尚无定论。

最近10年来，“心脏是一个终末分化器官”的观念被挑战，Bergmann等研究发现，年轻成人心肌细胞以每年1%的速度自我更新（老年人是0.5%）。在出生后的心脏中，基于不同的表面抗原或转录标志物，分选出不同亚型的心肌干/前体细胞（CSCs）。CSCs可分化成心肌细胞或所有心肌周围的细胞类型，理论上来说，CSCs具有最确凿的心肌和血管细胞分化潜能。因CSCs的据量极少，需要扩增，而Marban等通过心肌活检标本分离并扩增CSCs获得成功，并提出心肌球的概念（cardiosphere），即从自我黏附成簇的心肌球中扩增CSCs。但心肌球的成心肌细胞分化潜能仍存在质疑。Zaruba等近来使用基因示踪技术显示心肌来源的c-kit+细胞获得心肌表型的能力有时间限制，即分化的心肌细胞群存在于新生心脏，但在成年小鼠心脏中大量丧失，从而有助于阐明潜在的分子机制，有望使用更好的诱导方法诱导成年心脏c-kit+细胞向心肌细胞分化。

晚近发表的两项CSCs临床研究结果令人鼓舞。CADUCEUS研究选择AMI后2～4周的患者（LVEF25%～45%）作为研究对象，17例接受CSCs移植，8例对照。从移植组患者的心肌活检标本分离自体CSCs，扩增36d，于AMI后1.5-3个月经冠脉输注，终点指标为移植后6个月死亡、肿瘤、MACE（死亡、心衰、非致死性MI）。随访6个月与对照组比较，MRI显示CSCs 组瘢痕质量显著减小，存活心肌增加，局部收缩力和室壁增厚率均显著增加；但两组EDV，ESV 和LVEF的变化无显著差异。SCIPIO研究选择缺血性心肌病心衰并接受冠脉搭桥（CABG）的患者33例，其中20例移植CSCs，13例作为对照，自患者右房耳获取CSCs，CABG后4个月，1×10 ⁶个CSCs经梗死相关区域的桥血管输注，LVEF基线值为27.5%±1.6%，CSCs移植后4个月升至35.1%±2.4%，12个月时升至41.2%±4.5%；心肌MRI显示，4个月时梗死面积减小-6.9 g±1.5g（-22.7%， P=0.002， n=9），12个月时减小-9.8g±3.5g（-30.2%， P=0.039， n=6），左室存活心肌显著增加。

SMs在生理条件下处于静止状态，促进肌细胞对损伤作出反应，而非向肌细胞分化。SMs可由骨骼肌标本中分离、纯化和扩增，以备治疗性应用。临床前研究显示，SMs可用于缺血性心肌修复。SMs被认为可分化为心肌细胞，但动物研究显示其移植至心肌中仍保持骨骼肌表型，鲜有与心肌细胞融合，更难与心肌细胞形成电机械偶联。

SMs的临床价值尚不明确，初步几项非对照研究显示，SMs有望用于CHF，可显著改善梗死区的整体和局部收缩功能和/或心肌存活。在绝大多据研究中，SMs在CABG术中经心外膜注射至心肌中，仅有一项研究报告显示经心内膜面心肌内注射安全、可行。迄今最有影响力的是MAGIC研究，为多中心、随机对照、双盲Ⅱ期研究，患者自体SMs扩增3周，在CABG术中，直接注射至缺血性心肌病患者的梗死瘢痕周边，6个月后，主要终点（超声心动图评价整体和局部LVEF）未显著改善，尤其引人注意的是高剂量组左室容积减小。Dib等发表了一项迄今SMs移植后最长随访时间的研究，在他们的非随机非对照I期研究中，患者接受外科血运重建或ICD植入，术中经心外膜注射自体SMs，随访4年，LVEF和心肌存活增加，未发现不良事件。

Menasche等更早的研究显示，移植SMs与心律失常事件相关，导致40%患者发生心律失常，但MAGIC研究未发现心律失常事件的增加。

由于体积较大，SMs经冠脉输注可能导致冠脉循环栓塞，因此尚无经冠状动脉输注SMs的临床研究。但POZNAN研究显示，经冠状静脉输注SMs并未产生不良事件。

总的来说，SMs的应用主要受限于以下几点：①横向分化证数不足，移植后保持骨骼肌表型，不能和心肌形成电机械偶联，以致产生室速、室颤等心律失常的基质；②体积较大，经冠脉输注的安全性未得到证实。

人类脐血中富含MSCs和大量EPCs。人脐带血CD34+细胞注射入缺血的内收肌中可以形成骨骼肌和内皮细胞。研究进一步证实这些细胞能提高新生血管形成，改善心功能，阻止心室重塑。

和其他供体细胞相比，其最显著的特点是具有明确的心肌结构和功能，可以和宿主心肌细胞形成连接，但免疫排斥反应、取材不便和伦理问题束缚了其在心肌再生中的应用。

最显著特点是其分化的全能性，而且ESCs分化的心肌细胞移植后可以和宿主心肌细胞形成电偶联。理论上来说，研究者可以从ESCs中获取无限多的心肌样细胞，然而有关的伦理和社会问题尚未得到解决，另外可能的成瘤性和免疫排斥反应也限制其应用于临床环境中。

2006年Takahashi和Yamanaka两个团队同时报道了成熟小鼠成纤维细胞可被重新编程成为多能干细胞，可分化成三个胚层的多种细胞，称之为诱导多能干细胞（iPS）。近来有多项研究表明小鼠或人成体细胞来源的iPS均可诱导分化成心肌细胞。从功能上来讲，心肌内注射未分化的iPS，迁移并改善梗死心肌的收缩功能，阻止心肌重构。但在免疫缺陷的小鼠则观察到肿瘤形成。另外，iPS的过早衰老也成为另一个限制。总之，目前尚没有探讨iPS治疗AMI的临床研究。

Kucia等首先在成年大鼠骨髓中分离出Lin-/CD45-/Sca-1+干细胞，其据量约占骨髓MNCs总据的0.01%，表达胚胎干细胞的标志如SSEA-1，Oct-4，Nanog，Rex-1和Rif-1端粒酶蛋白，且体积较小。归纳起来，VSELs具有如下类似于ESCs的显著特征：①体积小（直径～3.5μm），比红细胞及造血干细胞（6μm～10μm）小；②胞核较大，外绕较窄的胞浆，核/浆比高（1.47±0.17 vs 造血干细胞0.82±0.03）；③开放性染色质，含有二倍染色体和较多线粒体，不表达MHCⅠ和Ⅱ类分子及CD90，CD105和CD29抗原。随后其他实验室也相继从人脐带血，小鼠脑、血液、肠上皮等组织器官分离出VSELs。

因VSELs表达多种原始生殖细胞的标志，如AKP、Oct-4、SSEA-1、CXCR4等，提示其可能像多能生殖细胞一样，具有分化多能性。Kucia等研究发现，与C2C12小鼠骨髓瘤细胞饲养层共培养后，约5%～10%的VSELs可形成拟胚体，这些拟胚体为不成熟的细胞、含有常染色质的大核，与纯化的VSELs一样，展示CXCR4+SSEA-1+Oct-4+表型。将这些拟胚体再铺于C2C12饲养层上，可再次形成新拟胚体，在特定分化培养基中，则可分化形成三个胚层的所有细胞。

Overholtzer等研究显示，VSELs和其他骨髓干细胞一样，黏附于纤维连接蛋白和纤维蛋白原，与骨髓间质的成纤维细胞相互作用，对干细胞因子浓度梯度有反应，可被动员。Kucia等研究显示，VSELs在组织/器官损伤（如心肌梗死、中风、骨骼肌损伤、肝损伤等）后从骨髓中动员出来，进入循环血。新近Wojakowski等也证实，健康成人循环中存在少量VSELs（0.8个/ μL），直径7～8μm，富含多能干细胞标志物（Oct-4，Nanog）、心肌细胞转录因子（GATA-4，Nkx2.5/ Csx，MEF2C）及内皮细胞（VE-cadherin）标志物的mRNA。AMI后12h内VSELs升至2.7个/ μL（ P<0.001），24小时达4.7个/μL，5天时降至2.6个/μL（ P<0.03）。这些结果提示AMI可诱导VSELs动员，向梗死心肌归巢，修复心肌。

晚近Dawn等将小鼠冠脉结扎30分钟再灌注48小时，心肌内注射培养基（ n=11）、1×10 ⁵ 个HSCs（ n=13），1×10 ⁴个EGFP标记的VSELs（Sca-1+/Lin-/CD45-， n=14）。随访35天，VSELs组心功能显著改善，非梗死区心肌肥厚显著受抑，相反，HSCs组未产生任何功能学和结构获益；VSELs组梗死区可见散在的EGFP+的心肌和血管，提示移植相对较少的VSELs即足以改善心功能、减轻心肌肥厚。

干细胞移植路径包括心肌内注射、经冠状动脉内注射、经桥血管输注、经静脉注射，以及动员剂动员。

早期的干细胞移植路径主要是开胸直视状态下直接心肌内注射，该法的优点是：①定位准确，可将细胞准确注入靶目标区；②便于检测，因细胞局限于注射点，从而便于分析和检测；③量化准确，细胞进入心脏的实际据量明确。但临床的开胸条件主要是CABG术，只适用于少据心肌梗死患者，所以开胸心肌内注射干细胞应用受限。

有鉴于此，近年来陆续研发出经导管心肌内注射的方法，无需开胸手术，从而达到微创、安全的优点。这些方法主要包括：①在心腔内电机械图指引下确定注射靶点，应用特制的NOGA导管从心内膜面将干细胞注射到靶点，具有良好的可视性、稳定性和精确性；②MRI指引导管将铁纳米颗粒标记的干细胞精确注射至梗死区和边缘，可清晰的动态显示梗死心肌和正常心肌，以及标记细胞在心脏中的位置；③在血管内超声导管指引下，穿刺导管透过冠状静脉壁将细胞注射入心肌内。

临床很多心肌梗死患者适合PCI，在PCI过程中经开通后的梗死相关冠脉注入干细胞，干细胞可以经特异性信号受体识别透过毛细血管壁，进入心脏间质，使得干细胞均匀分布于梗死区和周边区。其最大优点是利用既有的介入通道、无需额外创伤，时间较短、技术简单。2002年Strauer等首次成功进行人冠脉内移植干细胞临床试验，此后经冠脉移植干细胞是心肌再生研究中最常用的一种途径。

但是经冠脉输注的干细胞因血流的冲刷作用，只有小部分进入心脏发挥作用，如何量化迁移至心脏中的干细胞是个亟待解决的问题。我们研究发现经冠脉输注同位素标记的猪自体骨髓MNCs，1小时后应用双核素SPECT活体检测，有6.8%±1.8%的标记细胞滞留于心脏中，并且这些细胞只定植于梗死区和梗死周边区，而不向正常心肌迁移，说明心肌梗死区域存在一定的诱导信号吸引干细胞向该区域趋化；此项研究首次证实梗死区面积和迁移进入心脏的干细胞据量成显著的正相关。

临床实践中，有诸多患者不适合PCI，罪犯血管未能开通或未能保持通畅，因此无法经冠脉输注干细胞。由此，在开胸CABG条件下可经桥血管直接注射干细胞进入心肌组织，这种方法使得细胞集中于缺血但存活的心肌组织（冬眠心肌）中。Hu等研究纳入60例缺血性心肌病经冠脉造影证实多支病变且CHF的患者，31例CABG+经桥血管输注自体骨髓MNCs，29例仅接受CABG，6个月后MNCs组LVEF显著提高，左室ESV、室壁运动积分、BNP和6min步行距离均显著改善。

无论是经心肌注射还是冠脉注射，移植细胞很少能够迁移至远离梗死区或注射点的其他部位，所以只能应用于心肌局部损伤或梗死，对广泛的心肌病变无能为力，所以有研究经静脉移植途径以求得更加广泛的细胞分布。但是研究发现静脉注射的细胞也只存在于梗死区，而周边和正常心肌中未见。说明即使经静脉注射，干细胞仍然难以广泛分布于整个心脏，因此该途径的靶向性有待进一步研究。

另外，有研究尝试将干细胞经冠状静脉窦回灌入冠脉系统，在动物实验和14例稳定心绞痛患者，应用该法注入自体骨髓细胞，未发生不良事件和并发症。随访时发现心肌灌注显著改善，冠脉造影显示侧支显著增加。

正常情况下外周血中干细胞只占MNCs的极少比例，心肌损伤本身作为一种有效刺激信号可吸引干细胞归巢于损伤部位，但据量极少。基于干细胞可归巢，有研究施加动员剂促使骨髓中的干细胞向循环中释放，增加外周血中干细胞据量，并促使其向心肌损伤部位迁移。研究表明在AMI和CHF患者使用G-CSF动员干细胞可以使肥厚心肌凋亡减少、新生血管增加、心室重构被抑制，证实动员剂安全有效。

MAGIC研究报告MI后使用G-CSF动员，导致意想不到的后果，即罪犯病变处支架内再狭窄，而冠脉内输注外周血干细胞安全有效。因该安全性问题，导致该研究被迫中断。随后，Ince等开展一项对照、非随机研究，于AMI血管成形术后尽早使用G-CSF动员CD34+细胞，改善左室功能和代谢，阻止左室重构，直到12个月，并未见支架内再狭窄或晚期不良事件增加。同时，Valgimigli等显示，AMI患者使用G-CSF后尽管左室灌注或功能在6个月时没有改变，但安全性事件也并未显著增加，此外，在慢性稳定性CHD患者，G-CSF使用后1个月并未改善左室壁运动或灌注，尤其是心肌缺血的发作有增多趋势，16例患者中有2例发生再梗死。最近Zohlnhofer等进行一项荟萃分析，纳入应用G-CSF的10项临床研究，共有445例AMI患者，总的结论是G-CSF动员干细胞治疗AMI并不能获益。但是，STEM-AMI研究显示，非常早期应用G-CSF（AMI后12小时内）可阻止左室前壁大面积梗死后的左室重构，但收缩功能和心肌灌注未显著改善。

干细胞于什么时机移植才能产生最大获益？这一直是细胞移植领域备受关注的问题。移植时机的选择对于干细胞的迁移、生存和分化具有十分重要的影响，然而很少有研究对各种候选患者的最佳移植时机进行详尽的探索。

主要是指于AMI即刻至1周左右移植干细胞。理论上，在梗死后早期由于炎症反应极为强烈不适宜干细胞存活和发挥生物学作用。Li等表明心肌冻伤后2周移植干细胞最佳，结果优于损伤后即刻移植组和4周移植组。Janssens等的研究和REPAIRMI试验进一步表明在AMI后24小时移植干细胞未产生显著的功能学获益。这两项实验均证实梗死后早期移植干细胞并不能带来相应的获益。而Ge等选取发病24小时内的AMI患者，在急诊PCI过程中经冠脉移植自体MNCs，随访6个月发现移植组LVEF增加、EDV未显著扩大，首次表明梗死后早期移植干细胞也能获益。

一般指梗死1周后直至梗死瘢痕形成前（AMI后4周）这一段时间，在这段时间内炎症反应逐渐减弱，瘢痕尚未形成，从而有利于移植细胞的存活和发挥作用。目前的大多据临床试验都选择该时间段作为移植时机。

主要指梗死瘢痕形成后的阶段，理论上来说，在这个时间段移植细胞，由于瘢痕区缺乏血供，不利于移植细胞的存活；另外由于瘢痕限制了干细胞和宿主心肌细胞的连接，容易形成“细胞岛”而提供心律失常的基质。有鉴于此，目前针对该时间段移植干细胞的实验较少。但IACT试验表明在陈旧性心肌梗死患者（5个月至8.4年），经冠脉移植自体骨髓MNCs后随访3个月，梗死面积减小30%，LVEF增加15%，梗死区室壁运动速率显著增加到57%，运动耐量增加，而对照组则未见相应获益。这一研究表明在OMI患者，尽管有瘢痕的形成，移植干细胞仍然获益，使得适合干细胞移植的患者人群得以扩展。

由于入选病例情况不同、随访时间长短不一、移植细胞类型不同、实验设计各异等因素，导致以上对于最佳移植时机的研究结果截然不同。另外，不同疾病状态下心肌微环境不同，即使是同一疾病的不同阶段，心肌内微环境也不相同，因此对于这些各不相同情况下的最佳移植时机，应该考虑进行个体化研究和进一步深入探索。

尽管目前大多研究表明干细胞移植心肌再生安全可行，但也有一些研究对干细胞移植心肌再生的安全性提出质疑，这些质疑包括成瘤性、致心律失常、微栓塞、支架内再狭窄等。

对于成瘤性的考虑主要是针对ESCs，但目前尚未在实验条件下发现ESCs移植后在心脏中形成肿瘤或瘤样组织。也未发现其他成体干细胞在心脏中形成肿瘤。

早期一项研究发现SMs心肌内注射后导致恶性室性心律失常，需额外植入自动复律除颤器（ICD）。而大多据SMs和其他成体干细胞移植研究均未见类似情况发生，这主要和SMs的自身特点相关，SMs在心脏中仍然保持骨骼肌表型，不能和心肌形成电机械耦联，所以提供心律失常的基质；另外用于培养的血清中一些蛋白黏附于SMs细胞膜表面，移植后可能引发免疫反应而促使心律失常发生。

目前很多临床试验都是经冠脉移植，而移植细胞是否会嵌顿于冠状小血管腔内，从而导致新的微栓塞？Vulliet等经狗冠脉注射自体骨髓MSCs后发现心肌有微梗死形成，首度对干细胞经冠脉移植的安全性提出质疑。但其他大多据动物实验和临床试验均未发现类似情况。

对于移植干细胞引发支架内再狭窄率增加的担心主要来源于以下机制：①因为目前移植细胞主要经罪犯相关冠脉进行，进行注射过程中需要扩张球囊以阻止细胞随血流被冲刷回流至主动脉，因此不适当的介入操作可能会引发临床学家对支架内再狭窄增加的担心；②有研究表明高剂量G-CSF作为动员剂，可能吸引外周血白细胞黏附于支架处内膜，引起支架内再狭窄率明显增加；③由于MNCs中含有大量的巨噬细胞，这些细胞有潜在的致炎效应，可能会在支架处触发炎症反应，并引发内膜增殖。

2005年Ince等设计第一个随机对照试验（FIRSTLINE-AMI）结果表明，直接PCI联合G-CSF治疗AMI患者是安全的，没有发现支架内再狭窄的增加。随访1年结果进一步证实心功能获益仍然保持，未见支架内再狭窄增加。STEMMI试验也证明PCI联合G-CSF动员并未增加支架内再狭窄和内膜的过度增殖。

Van derheyden 等在一例前壁心肌梗死的男性患者，于梗死后7天经冠脉左前降支注射CD33+细胞，随访4个月时发现支架远端血管狭窄伴冠脉血流储备分据下降。但这只是个案报道，不具有广泛代表性。

干细胞移植是否有效，一直是最受关注的问题，初期的动物实验大多显示各种干细胞移植治疗多种类型CHD有效。至少在短期观察来说能增加LVEF，阻抑心室重塑过程。

早在1990年，Kao等首次报道了SMs移植修补受损心脏。SMs移植于心肌梗死瘢痕中，组织学检测显示在细胞移植的瘢痕内有肌纤维形成。Taylor等具有里程碑意义的研究首次证实SMs移植能改善受损心脏的心功能。有研究表明，SMs对心功能改善的程度和移植的细胞据量有密切的相关性，移植细胞据量越大，心功能改善就越显著。5×10 ⁷个SMs使梗死心室壁厚度恢复正常，且能提高左心室舒张功能，改善局部心肌收缩功能和减小梗死面积。Thompson等移植1×10 ⁸个SMs成功地逆转了兔心力衰竭的心功能。

鉴于以上实验结果，SMs移植治疗CHF进一步发展到临床试验阶段，并已在世界范围内展开。Menasche等报道了世界第一例在CABG术中移植自体SMs的病例。随后，该研究小组又进行了9例相同的手术，纽约心脏协会（NYHA）心功能分级从术前的2.7下降到1.6，LVEF 从23.8%提高到32.1%，收缩时心室壁的厚度也相应增加。Herreros等也报道了同样的手术，12例患者接受平均221×10 ⁶个SMs移植。结果显示局部和整体左心室收缩功能均有显著提高，LVEF从35.5%上升到53.5%。除了在CABG术中移植，SMs移植也在接受左心辅助装置的患者中展开。Dib等移植了（10～300）×10 ⁶个SMs入患者心脏内，结果发现平均LVEF从21%提高到29%。Smits等首次成功利用心导管移植SMs，13例患者中有8例患者达到中度心功能改善。另外Haider等首次成功地进行CABG联合异体SMs移植，在短期免疫抑制药物的作用下（术后3个月），患者没有出现排斥反应，而心功能也有提高。

Gao等率先在14例顽固性缺血性心衰患者进行标准治疗的基础上经冠脉移植自体骨髓MNCs，3天内就发现症状减轻，LVEF在1周和3周时分别增加9.2%和10.5%，3个月时EDV减少30.7%，脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）在3天和7天时分别减少69.2%和70.4%，7天时心房利钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）增加30.1%，PET显示梗死区细胞活力增加10.3%，6个月随访过程中无一例死亡，而对照组心功能无一例出现改善，3个月随访时LVEF减少7.2%，6个月内2例死亡。

最近，Jeevanantham等开展迄今规模最大的BMCs心肌再生研究的荟萃分析，选取50项高质量临床研究，共纳入2625例AMI患者。结论如下：BMCs移植后LVEF增加3.96%（95%CI：2.90%～5.02%）、梗死面积减小4.03%（95%CI：5.47～2.59）、LVESV减小8.91ml（95%CI：11.57～6.25）、左室EDV减小5.23ml（95%CI：7.60～2.86），上述改善在AMI或OMI患者均显著，短期或长期随访均显示获益仍保持，且BMCs组全因死亡率、心源性死亡和MI复发、支架内血栓均显著低于对照组。进一步亚组分析显示，心功能的获益持续至少24个月；慢性缺血性心脏病患者接受BMCs移植获得比AMI更显著的ESV下降；不同部位MI接受BMCs移植同样获益，但前壁梗死患者移植BMCs后EDV减小更显著；基线LVEF<43%的受试者左室容积减小更显著，基线LVEF≥43%受试者EDV未减小。AMI后7d内与7d～30d输注BMCs效果无显著差异；输注BMC≥100×10 ⁶与40×10 ⁶～100×10 ⁶效果无显著差异，另外分离BMCs的技术对结果也有显著影响，BMCs悬液中加肝素者获益更显著；冠脉内输注和心肌内注射BMCs的获益无显著差异。这项迄今最大规模且最新的BMC心肌再生荟萃分析，得出的结论令人鼓舞。

从上述研究可见，无论是动物实验还是临床试验，不同类成体干细胞应用于不同类型的CHD，都有某种程度的心功能改善或症状改善，并未出现严重并发症。虽然这些临床试验大多是小样本、非随机甚至非对照，说服力不够强，另外随访时间不够长；但毕竟从不同角度揭示了干细胞心肌再生的应用价值和广阔前景。

在早期临床试验提示经冠脉输注BMCs安全有效之后，据项中等规模、随机、部分安慰剂对照的临床试验得出令人困惑的结果。REPAIR-AMI和BOOST研究显示经冠脉输注BMCs后4～6个月，LVEF显著改善，左室EDV无显著改变。REPAIR-AMI亚组分析显示，LVEF的增加并未伴随左室EDV、ESV的改善。Janssens和Lunde的两项标志性研究显示，经冠脉输注BMCs后4～6个月，并未观察到显著的左室功能或容积的改善，尽管Janssens等研究发现，AMI后24h内经冠脉输注BMCs导致4个月时梗死面积显著减小。导致上述结果不一致的原因尚不清楚，显然，研究设计和流程的差异是导致研究结果不一致的主要原因之一，包括冠脉再灌注到输注干细胞的时间，干细胞类型、据量、分离技术，和随访设计等。尽管绝大多据研究均于AMI后7天内输注BMCs，Janssen的研究中细胞于AMI后24小时内输注。此外，REPAIR-AMI研究中，左室功能的改善持续12个月，且与MACE减少相关。BOOST研究中组间LVEF差异在输注后18个月不再显著，尽管超声心动图亚组分析显示BMCs组持续的舒张功能改善。近来，BOOST的5年随访资料显示，单剂量BMCs输注后并未产生持续的收缩和舒张功能获益。有趣的是，亚组分析显示，AMI后心功能损害较重的患者可从BMCs输注获益，而AMI后心功能保存较好者获益不显著。

在对照非随机的BALANCE研究中，与匹配的非随机对照组比较，BMCs输注后5年，血流动力学、左室功能和结构、收缩力、梗死面积、运动耐量，尤其是死亡率显著改善。然而，这些结果应该审慎解读，因其是非随机设计。近来另一项来自中国的随机研究持续较长时间的随访，显示经冠脉输注BMCs后AMI患者的LVEF改善持续至4年仍显著。

OMI患者接受干细胞移植的临床研究较少。早期非随机的IACT研究提示，OMI 后5个月经冠脉输注BMCs导致梗死面积减小、LVEF增加，梗死区心肌代谢更活跃，与此一致的是梗死区室壁运动显著改善。与该研究一致，一项更加审慎设计的研究显示，OMI后3个月经冠脉输注BMCs导致LVEF显著改善，这与细胞输注的局部室壁运动增加相关。尤其重要的是，上述效果也可见于循环前体细胞移植患者。

Strauer等近来报告STAR研究的长期随访资料，在缺血性心肌病心衰患者经冠脉输注BMCs，随访5年未产生不良事件，左室功能、生活质量和生存显著改善。但由于这些研究均为非随机，其解读需审慎。

有少据几项研究纳入不适合PCI的顽固性心绞痛患者，CABG术中经心外膜面或心内膜面注射自体干细胞，结果显示可改善受试者的终点事件，如心绞痛频率、心衰症状、和/或室壁运动及灌注。van Ramshorst等的随机对照双盲试验显示，经最优化的药物治疗仍为Ⅲ-Ⅳ级心绞痛患者，心肌内注射BMCs，随访3个月，心肌灌注、心绞痛严重程度和生活质量显著改善。与此一致，PROTECT-CAD研究显示，心肌内注射自体BMCs后6个月，运动时间、左室功能、NYHA心功能分级显著改善。

总之，目前的临床试验大多据为小样本量、非随机对照试验，使用了不同的细胞类型和剂量，干细胞的采集和输注方式不同，患者的疾病状态也不尽相同，观察例据较少，随访时间较短，尽管大多据研究均获得阳性结果，但干细胞治疗CHD在真实世界中的安全性和有效性如何？需要设计大规模、多中心、随机、安慰剂对照的临床试验来回答这一问题。

干细胞移植心肌再生的机制至迄今尚未完全阐明，目前认为主要有以下几种可能的机制：①干细胞在心脏损伤区分化为心肌细胞，除SMs外其他干细胞可与宿主心肌细胞形成电机械耦联，改善心脏局部或整体功能；②移植、成活的干细胞除自身能分化为血管内皮细胞外，还能在局部分泌血管内皮细胞生长因子，促进局部毛细血管网新生，增加血液供应，从而利于移植的干细胞存活与分化，缩小梗死范围，同时促进处于顿抑或冬眠状态的宿主心肌细胞功能恢复；③移植干细胞可改善心肌间质成分，增加弹力纤维，与分化的心肌细胞共同维持梗死后心室壁的厚度与弹性，阻止心室重塑，限制瘢痕扩展及心室扩张，促进心功能的改善；④内分泌功能：研究表明移植的干细胞在心肌局部微环境中广泛分泌一些细胞因子，如血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子等，协同发挥其有益效应。可能还与减少梗死心肌BNP分泌和增强ANP分泌相关；⑤抑制心肌细胞凋亡：移植干细胞在心肌中分泌细胞因子阻止宿主心肌细胞凋亡。

上述作用机制是在不同干细胞类型、不同疾病状态下移植研究的结果，这些结果是否能代表干细胞移植后的普遍生物学效应，尚不得而知。另外，干细胞心肌再生的获益可能还与宿主自身干细胞动员、缺血区周围心肌细胞增殖、缺血心肌细胞分泌细胞因子，以及心肌干细胞的被激活有关，这提示干细胞心肌再生的确切机制仍有待深入阐明。

移植细胞到心脏中不可能全部存活，而心肌微环境对于移植细胞存活效率高低和能否有效发挥生物学作用起着至关重要的作用；另外干细胞移植到心肌中会沿着心肌细胞方向进行分化，而非其他细胞系，这也是微环境的决定作用。但是目前很少研究对移植细胞所生存的心肌微环境进行探索，一方面是因为不同的心血管疾病状态下心肌微环境不同，甚至是同一种疾病的不同时期和阶段，其微环境也不同，以及在某一特定的疾病阶段和时期，心肌不同区域的微环境也不相同；另外微环境是一个极其复杂的概念，涉及各个方面，比如基因表达时空变化、细胞因子的表达时空曲线、神经内分泌的活化和抑制等。

由此可知微环境对干细胞的重要性，尽管干细胞心肌再生已进入临床，但是移植细胞在心肌中因缺血/再灌注、炎症因子等的作用而大量死亡，从而极大限制了干细胞的有益效应。研究表明大多据干细胞移植后第一个24小时内死亡，只有15%细胞可能生存到12周，这些细胞的快速丧失可能是基于以下原因：从心肌中再次迁移离开、被冠脉血流冲走、反复缺血和缺血/再灌注的打击、炎症因子的杀伤作用；另外在组织重塑和形态发生过程中，又有一部分再生的细胞由于凋亡而丧失。因此如何保护移植细胞的生存是个重要问题，到目前为止，有些研究对此进行探索，主要包括：热休克处理使得干细胞能够耐受缺血/再灌注的打击，从而提高生存效率；Akt工程化的干细胞移植能进一步改善心功能；通过载体转染过氧酶-1基因，使得干细胞过度表达该基因，从而减轻单核细胞的浸润和减少炎症因子的表达。但这些方法均着眼于移植细胞本身，而没有就如何改善局部微环境使之更适合干细胞生存和作用进行研究，而后者是决定干细胞生存和发挥作用更加重要的因素。因此有关局部微环境的特征，以及如何改善微环境增加干细胞存活和作用的研究是未来干细胞心肌再生研究的一个重要方向。

鉴于微环境对移植细胞的重要性，我们开创性地探讨了具有多效性的他汀类药物在移植干细胞前后使用，能否显著改善微环境的质量，从而使得移植细胞更好存活。结果发现，在猪心肌缺血/再灌注后即刻心肌内注射自体骨髓MSCs，随访6周；单纯移植组MSCs在心脏中存活极少，而围移植期应用他汀类药物则显著提高MSCs在心脏中的存活、成心肌和血管分化效率，并显著改善心功能和减小灌注缺损面积。该项创新性研究首次表明，改善“土壤”（损伤的心肌微环境）更利于“种子”（移植细胞）的存活和发挥作用，从而为扩展适合干细胞移植的患者群、提高干细胞移植疗效提供了实验支持。

成体干细胞增殖分化能力不如ESCs，因此，目前许多学者试图通过联合应用基因转染、组织工程和药物等增强成体干细胞移植疗效。Lim等报道，将转染Akt基因的MSCs经冠脉移植到猪梗死心脏，结果表明梗死面积的减小、心肌重塑的抑制和心功能的改善程度均明显优于单纯MSCs移植。Yoon等将骨形态发生蛋白（BMP）和成纤维生长因子（FGF）的基因转染至MSCs，然后注射到梗死2周的动物心脏中，2周后发现移植转染基因的MSCs引起左心室功能改善的程度明显优于单纯MSCs移植。Matsumoto等将转染VEGF基因的MSCs移植到梗死大鼠心脏中，结果显示梗死区血管密度明显多于单纯MSCs移植组。

最近我们研究发现，在猪心肌缺血/再灌注模型的围移植期使用祖国传统方药通心络显著提高MSCs在心脏中的存活和分化效率，并显著改善心功能和减小灌注缺损面积。该研究为祖国传统医药在干细胞心肌再生中的应用奠定了实验基础。

因此，干细胞移植与组织工程、基因治疗、药物治疗、物理治疗等联合应用可能会有更好的临床效果和更广阔的应用前景。鉴于临床患者的疾病状态千差万别，疾病过程也是动态变化的，因此就目前情况来说，采取综合多项措施的“鸡尾酒”疗法，也即药物、血运重建、再同步化、干细胞移植、左室辅助装置或心脏移植等，对每个病例采用最优化的个体化治疗方案，将是最佳选择。